Обзор нескольких методов микроскопии сверхвысокого разрешения
Для обычной световой микроскопии дифракция света ограничивает разрешение изображения примерно до 250 нм. Сегодня методы сверхвысокого разрешения могут улучшить это более чем в 10 раз. Этот метод в основном достигается с помощью трех методов: микроскопия локализации одиночных молекул, включая фоточувствительную микроскопию локализации (PALM) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM); микроскопия структурированного освещения (SIM); и стимулированная эмиссионная микроскопия истощения (STED). Как выбрать технологию сверхвысокого разрешения — это то, что волнует всех. «К сожалению, нет простых принципов для принятия решения о том, какой метод использовать», — говорит Мэтью Стрейси, научный сотрудник Оксфордского университета, Великобритания. «У каждого есть свои преимущества и недостатки». Ученые, конечно, также выясняют, как выбрать правильный метод для конкретного проекта. «В контексте биовизуализации ключевыми факторами, которые следует учитывать, являются: пространственное и временное разрешение, чувствительность к фотоповреждениям, способность к маркировке, толщина образца и фоновая флуоресценция или аутологическая флуоресценция клеток». Как это работает Различные микроскопы сверхвысокого разрешения работают по-разному. В случае PALM и STORM в данный момент возбуждается или фотоактивируется лишь небольшая часть флуоресцентных маркеров, что позволяет проводить их независимую локализацию с высокой точностью. Прохождение этого процесса со всеми флуоресцентными метками приводит к получению полного изображения сверхвысокого разрешения. Стефан Хелл, один из лауреатов Нобелевской премии по химии 2014 года и директор Института биофизической химии им. Макса Планка, сказал: «Систему PALM/STORM относительно легко настроить, но ее сложно применять, потому что флуоресцентная группа должна обладать способностью к фотоактивации. Ограничения Недостатком является то, что они должны обнаруживать одну флуоресцентную молекулу в контексте клетки, и они менее надежны, чем STED». STED использует лазерный импульс для возбуждения флуорофора и кольцеобразный лазер для гашения флуорофора, оставляя только флуоресценцию промежуточного нанометрового размера для сверхразрешения. Сканирование всего образца дает изображение. «Преимущество STED в том, что это кнопочная технология», — объяснил Хелл. «Он работает как стандартный конфокальный флуоресцентный микроскоп». Он также может отображать живые клетки с помощью флуорофоров, таких как зеленые или желтые флуоресцентные белки и красители на основе родамина. Параметрическое сравнение Хотя все методы сверхвысокого разрешения превосходят обычную световую микроскопию с точки зрения разрешения, они отличаются друг от друга. SIM примерно удваивает разрешение примерно до 100 нм. PALM и STORM могут определять цели размером 15 нм. По словам Хелла, STED обеспечивает пространственное разрешение 30 нм в живых клетках и 15 нм в фиксированных клетках. Когда дело доходит до конкретных приложений, мы также должны учитывать отношение сигнал/шум. В некоторых случаях более низкое разрешение, но более высокое отношение сигнал/шум может привести к лучшему изображению, чем наоборот (более высокое разрешение, но более низкое отношение сигнал/шум). Скорость получения изображения также очень важна, особенно для живых клеток. «Все методы сверхвысокого разрешения работают медленнее, чем обычные методы флуоресцентной визуализации», — сказал Стрейси. «PALM/STORM — самая медленная, для получения одного изображения требуются десятки тысяч кадров, для SIM — десятки кадров, а STED — это технология сканирования, поэтому скорость получения зависит от размера поля зрения». В дополнение к живым клеткам или фиксированным клеткам визуализации некоторые ученые также хотят понять, как движутся объекты. Стрейси интересуется динамикой биологических систем в живых клетках, а не только статическими изображениями. Он сочетает PALM с отслеживанием отдельных частиц для анализа динамики живых клеток. Таким образом, он может напрямую отслеживать молекулы-маркеры, когда они выполняют свои функции. Однако он считает, что SIM не подходит для изучения этих динамических процессов на молекулярном уровне, но из-за его высокой скорости сбора данных он особенно подходит для наблюдения за динамикой более крупных структур, таких как целые хромосомы. Последние результаты В 2017 году команда Ада сообщила о микроскопе сверхвысокого разрешения MINFLUX в журнале Science. По словам Хелла, этот метод сверхвысокого разрешения впервые обеспечивает пространственное разрешение 1 нм. Кроме того, он может отслеживать отдельные молекулы в живых клетках как минимум в 100 раз быстрее, чем другие методы. Другие ученые также высоко оценили микроскоп MINFLUX. «Постоянно разрабатываются новые приложения и подходы, но мне особенно запомнились два достижения, — сказал Шехтман. Одним из них является МИНФЛЮКС. «Он использует оригинальный подход для получения очень точного молекулярного позиционирования». Что касается второго интересного события, Шехтман упомянул У. Э. Мёрнера и его коллег из Стэнфордского университета. Мёрнер также был лауреатом Нобелевской премии по химии 2014 года. Один из победителей. Чтобы устранить ограничение разрешения изображения, вызванное анизотропным рассеянием флуоресцентных одиночных молекул, ученые использовали различные поляризации возбуждения для определения ориентации и положения молекул. Кроме того, у них развита нежная поверхность зрачка. Эти методы улучшают способность локализовать структуры. О флуоресцентных этикетках Во многих приложениях со сверхвысоким разрешением этикетки действительно имеют значение. Есть также некоторые компании, которые предоставляют сопутствующие товары. Например, немецкая компания Miltenyi объединилась с Abberior, компанией, основанной Стефаном Хеллом, для предоставления индивидуальных услуг по конъюгации антител для красителей для микроскопии сверхвысокого разрешения. Ряд других компаний также предлагают соответствующие маркеры. «Наши Nano-Boosters очень малы, всего 1,5 кДа, и очень специфичны», — говорит Кристоф Эккерт, директор по маркетингу ChromoTek. Эти белки связывают зеленые и красные флуоресцентные белки (GFP и RFP). Они получены из фрагментов антител альпаки, известных как VHH или нанотела, с превосходными свойствами связывания и стабильным качеством без изменений от партии к партии. Эти маркеры подходят для различных методов сверхвысокого разрешения, включая SIM, PALM, STORM и STED. Ай-Хуи Тан, доцент Медицинской школы Университета Мэриленда, и его коллеги использовали ChromoTek GFP-Booster и STORM для изучения распространения информации в нервной системе. Они обнаружили молекулярные нанокластеры, называемые наноколонками, в пресинаптических и постсинаптических нейронах. Ученые считают, что эта структура показывает, что центральная нервная система использует простые принципы для поддержания и регулирования эффективности синапсов. Различные версии изображений сверхвысокого разрешения и растущее число методов еще больше углубляют ученых в биологические тайны. Преодолев дифракционный предел видимого света, биологи могут даже «внимательно следить» за действиями клеток.
