Знание конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии: используйте точечный источник света для освещения образца так, чтобы образовалось небольшое четко выраженное световое пятно в фокальной плоскости. Флуоресценция, излучаемая пятном после освещения, собирается объективом и возвращается в дихроичное зеркало по первоначальному пути освещения. представляют собой светоделитель. Спектрометр посылает флуоресценцию непосредственно на детектор. Перед источником света и детектором имеется точечное отверстие, которое называется точечным отверстием освещения и точечным отверстием обнаружения соответственно. Геометрические размеры обоих одинаковы, около 100-200 нм; По отношению к световой точке в фокальной плоскости они являются сопряженными, то есть световая точка проходит через ряд линз и в конечном итоге может быть сфокусирована на точечном отверстии освещения и точечном отверстии обнаружения одновременно. Таким образом, свет из фокальной плоскости может быть сконцентрирован в пределах диапазона детекторного отверстия, в то время как рассеянный свет сверху или снизу фокальной плоскости блокируется за пределами детекторного отверстия и не может быть отображен. Образец сканируется лазером по точкам, а фотоумножительная трубка за точечным отверстием также получает конфокальное изображение соответствующей световой точки поточечно, которое преобразуется в цифровой сигнал, передается на компьютер и, наконец, агрегируется на компьютере. на экране в четкое конфокальное изображение всей фокальной плоскости. .
Каждое изображение в фокальной плоскости фактически представляет собой оптическое сечение образца. Это оптическое сечение всегда имеет определенную толщину и также называется оптическим тонким сечением. Поскольку интенсивность света в фокусе намного превышает интенсивность света в нефокусе, а свет нефокальной плоскости фильтруется точечным отверстием, глубина резкости конфокальной системы равна примерно нулю. Сканирование в направлении оси Z позволяет реализовать оптическую томографию, формируя желаемое изображение. Наблюдайте за двумерным оптическим срезом в сфокусированном пятне образца. Комбинируя сканирование плоскости XY (фокальной плоскости) со сканированием по оси Z (оптической оси), накапливая непрерывные уровни двумерных изображений и обрабатывая их с помощью специализированного компьютерного программного обеспечения, можно получить трехмерное изображение образца.
То есть точечное отверстие обнаружения и отверстие источника света всегда фокусируются в одной и той же точке, так что флуоресценция, возбуждаемая за пределами плоскости фокусировки, не может проникнуть в точечное отверстие обнаружения.
Простое выражение принципа работы лазерного конфокального устройства заключается в том, что в качестве источника света он использует лазер. На основе традиционной флуоресцентной микроскопической визуализации добавляются устройство лазерного сканирования и сопряженное фокусирующее устройство, а система управляется компьютером для сбора и обработки цифровых изображений.
