Классификация и работа микроскопов для исследования клеток
Микроскоп является основным инструментом для наблюдения за клетками. По разным источникам света его можно разделить на две категории: оптические микроскопы и электронные микроскопы. В первом в качестве источника света используется видимый свет (в УФ-микроскопах используется ультрафиолетовый свет), а во втором в качестве источника света используются электронные лучи.
-,Оптический микроскоп
(1) Обычный оптический микроскоп
Обычные биологические микроскопы состоят из трех частей, а именно: ① система освещения, включающая источник света и конденсор; ② система оптического увеличения, состоящая из объектива и окуляра, которая является основным корпусом микроскопа. Чтобы устранить сферическую и хроматическую аберрации, как окуляр, так и объектив ③ Механическое устройство, используемое для фиксации материала и облегчения наблюдения (рис. 2-1).
Ясность изображения микроскопа определяется не только увеличением, но и разрешением микроскопа. Разрешение относится к способности микроскопа (или человеческого глаза, находящегося на расстоянии 25 см от цели) различать наименьшее расстояние между объектами. Величина разрешающей способности определяется Длина волны и светосила света, а также показатель преломления среды выражаются формулой:
В формуле: n=показатель преломления среды;=апертурный угол (угол раскрытия образца к апертуре объектива), NA=апертура объектива (числовая апертура). Угол линзы всегда меньше 180 градусов, поэтому максимальное значение sina/2 должно быть меньше 1.
Показатель преломления стекла, используемого для изготовления оптической линзы, составляет от 1,65 до 1,78, а показатель преломления используемой среды чем ближе к стеклу, тем лучше. Для сухих объективов средой является воздух, а светосила объектива обычно составляет от 0.05 до 0,95; для масляных линз в качестве среды используется кедровое масло, а светосила линзы может быть близка к 1,5.
Длина волны обычного света составляет {{0}} нм, поэтому значение разрешения микроскопа будет не менее 0,2 мкм, а разрешение человеческого глаза - 0,2 мм, поэтому максимальное увеличение общей конструкции микроскопа обычно составляет 1000X.
(2) Флуоресцентная микроскопия
Некоторые вещества в клетках, например хлорофилл, могут флуоресцировать после облучения ультрафиолетовыми лучами; некоторые вещества сами по себе не могут флуоресцировать, но если их окрасить флуоресцентными красителями или флуоресцентными антителами, то они могут флуоресцировать и при облучении ультрафиолетовыми лучами, и флуоресцентный микроскоп (рис. 2-2, 3, 4) является одним из инструментов для качественных и количественных исследований таких веществ.
Флуоресцентные микроскопы и обычные микроскопы имеют следующие отличия:
1. Метод освещения обычно эпииллюминационный, т. е. источник света проецируется на образец через объектив (рис. 2-3);
2. Источник света - ультрафиолетовый свет, длина волны короче, а разрешение выше, чем у обычных микроскопов;
3. Есть два специальных фильтра, один перед источником света используется для фильтрации видимого света, а другой между окуляром и объективом используется для фильтрации ультрафиолетового света для защиты глаз.
(3) Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп
Лазерный конфокальный сканирующий микроскоп (лазерный конфокальный сканирующий микроскоп, рис. 2-5, 6) использует лазер в качестве источника сканирующего света и сканирует изображение точка за точкой, линия за линией, поверхность за поверхностью, а сканирующий лазер и коллекция флуоресценции совместно используют линза объектива, и фокус линзы объектива Фокусная точка сканирующего лазера также является точкой объекта мгновенного изображения. Поскольку длина волны лазерного луча короткая, а луч очень тонкий, конфокальный лазерный сканирующий микроскоп имеет более высокое разрешение, которое примерно в 3 раза больше, чем у обычного оптического микроскопа. Система фокусируется один раз, и сканирование ограничивается одной плоскостью образца. Когда глубина фокусировки различна, можно получить изображения разных уровней глубины образца. Информация об этих изображениях хранится в компьютере. С помощью компьютерного анализа и моделирования можно отобразить трехмерную структуру образца клетки.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия может использоваться не только для наблюдения за морфологией клеток, но и для количественного анализа внутриклеточных биохимических компонентов, статистики оптической плотности и измерения морфологии клеток.
(4) Темнопольный микроскоп
Микроскоп темного поля (микроскоп темного поля, рисунок 2-7) имеет световой лист в центре конденсора, так что свет освещения не попадает непосредственно в человеческую линзу, а только свет, отраженный и преломленный образцом. допускается попадание в объектив, поэтому фон поля зрения черный, края объектов яркие. С помощью этого микроскопа можно увидеть частицы размером 4-200нм, а разрешение может быть в 50 раз выше, чем у обычных микроскопов.
(5) Фазово-контрастный микроскоп
Фазоконтрастный микроскоп (фазоконтрастный микроскоп, рис. 2-8, 9) П. Зернике был изобретен в 1932 г. и получил за него Нобелевскую премию по физике в 1953 г. Самая большая особенность этого микроскопа заключается в том, что он может наблюдать неокрашенные образцы и живые клетки.
Основной принцип фазово-контрастной микроскопии заключается в изменении оптической разности хода видимого света, проходящего через образец, в разность амплитуд, тем самым улучшая контраст между различными структурами и делая различные структуры четко видимыми. После прохождения через образец свет преломляется, отклоняется от исходного оптического пути и задерживается на 1/4λ (длины волны). Усильте, увеличьте или уменьшите амплитуду, увеличьте контраст. Конструктивно фазово-контрастные микроскопы имеют две особенности, отличающие их от обычных оптических микроскопов:
1. Кольцевая диафрагма расположена между источником света и конденсором, и ее функция заключается в том, чтобы свет, проходящий через конденсор, формировал полый световой конус и фокусировался на образце.
2. Фазовая пластина (кольцевая фазовая пластина) добавляет в линзу объектива фазовую пластину, покрытую фторидом магния, которая может задерживать фазу прямого или дифрагированного света на 1/4λ. Есть два типа:
①А плюс фазовая пластина: Прямой свет задерживается на 1/4λ. После объединения двух групп световых волн световые волны складываются, и амплитуда увеличивается. Структура образца ярче окружающей среды, образуя яркий контраст (или отрицательный контраст).
② B плюс фазовая пластина: дифрагированный свет задерживается на 1/4λ. После объединения двух наборов лучей световые волны вычитаются, и амплитуда становится меньше, образуя темный контраст (или положительный контраст), а структура темнее окружающей среды.
