Сравнение конфокального микроскопа и обычного оптического микроскопа
Общий оптический микроскоп
Общий биологический микроскоп состоит из трех частей, а именно: ① системы освещения, включая источник света и конденсатор; ② Система оптического усиления, состоящая из объектива и окуляра, является основным корпусом микроскопа. Чтобы устранить сферическую и хроматическую аберрацию, окуляр и объектив состоят из сложных групп линз; (3) механическое устройство, используемое для фиксации материалов и удобного наблюдения.
Четкость изображения микроскопа или нет зависит не только от увеличения, но и от разрешающей способности микроскопа. Разрешение относится к способности микроскопа (или места, где человеческие глаза находятся на расстоянии 25 см от цели) различать небольшой интервал объекта зуй. Разрешение зависит от длины волны света, светосилы и показателя преломления среды, что выражается формулой:
R=0.61λ /N．A． Н．А．＝ｎгрех /2
Где: n= показатель преломления среды;=угол зеркала (угол открытия образца по отношению к апертуре объектива) и числовая апертура NA=. Угол зеркала всегда меньше 180? Следовательно, значение zui для sina/2 должно быть меньше 1.
Показатель преломления стекла, используемого для изготовления оптических линз, составляет 1,65 ~ 1,78, а показатель преломления используемой среды чем ближе к показателю преломления стекла, тем лучше. Для сухого объектива средой является воздух, а светосила обычно равна 0.05 ~ 0,95; В масляной линзе в качестве среды используется ароматный асфальт, а скорость открытия линзы может достигать 1,5.
Длина волны обычного света составляет 400~700 нм, поэтому разрешение микроскопа составляет не менее 0,2 мкм, а разрешение человеческого глаза - 0,2 мм, поэтому большое увеличение Zui разработано общий микроскоп обычно 1000X x.
Зачем нужен конфокальный микроскоп?
1. Оптический микроскоп был усовершенствован благодаря усилиям и усовершенствованиям наших великих предшественников. Фактически, обычные микроскопы могут просто и быстро предоставить нам красивые микроскопические изображения. Однако произошло событие, которое принесло революционную инновацию в этот почти идеальный мир микроскопов: изобретение «лазерного сканирующего конфокального микроскопа». Этот новый микроскоп характеризуется использованием оптической системы, которая извлекает информацию об изображении только в той плоскости, где сосредоточен фокус, и восстанавливает полученную информацию в памяти изображения при изменении фокуса, так что получается яркое изображение с полной трехмерной информацией. может быть получен. С помощью этого метода можно просто получить информацию о форме поверхности, которую невозможно подтвердить обычными микроскопами. Кроме того, для обычных оптических микроскопов «улучшение разрешения» и «углубление глубины резкости» являются противоречивыми условиями, особенно при большом увеличении, а для конфокальных микроскопов эта проблема решена.
2. Преимущества конфокальной оптической системы
Конфокальная оптическая система освещает точку отбора пробы, а отраженный свет также воспринимается точечными рецепторами. Когда образец помещен в положение фокуса, почти весь отраженный свет может достичь фоторецептора, но когда образец отклоняется от фокуса, отраженный свет не может достичь фоторецептора. То есть в конфокальной оптической системе будет выводиться только то изображение, которое совпадает с фокусом, а факел и бесполезный рассеянный свет будут экранироваться.
3. Зачем использовать лазер?
В конфокальной оптической системе образец освещается, а отраженный свет также принимается точечным фоторецептором. Поэтому возникает необходимость в точечном источнике света. Лазер относится к очень точечным источникам света. В большинстве случаев источником света конфокального микроскопа является лазерный источник света. Кроме того, такие характеристики лазера, как монохроматичность, направленность и отличная форма луча, также являются важными причинами его широкого использования.
4. Становится возможным наблюдение в реальном времени на основе высокоскоростного сканирования.
При лазерном сканировании акусто-оптический дефлектор (основной элемент АО) используется в горизонтальном направлении, а серво-гальвано-зеркало — в вертикальном направлении. Поскольку в блоке акустического оптического отклонения нет механической вибрационной части, он может сканировать на высокой скорости, и за ним можно наблюдать в реальном времени на экране мониторинга. Высокая скорость этой камеры — очень важный проект, который напрямую влияет на скорость фокусировки и поиска позиции.
5. Связь между положением фокуса и яркостью
В конфокальной оптической системе при правильном расположении образца в положении фокуса яркость большая, а до и после нее ее яркость резко падает (сплошная линия на рисунке 4). Эта чувствительная избирательность фокальной плоскости также является принципом измерения направления высоты конфокального микроскопа и расширения глубины фокуса. Напротив, обычный оптический микроскоп не имеет явного изменения яркости до и после положения фокуса (пунктирная линия на рисунке 4).
6. Высокая контрастность и высокое разрешение.
В обычном оптическом микроскопе отраженный свет, отклоняющийся от фокуса, будет интерферировать и перекрываться с частью изображения фокуса, тем самым уменьшая контраст изображения. Напротив, в конфокальной оптической системе рассеянный свет вне фокуса и рассеянный свет внутри объектива практически полностью удаляются, поэтому можно получить изображение с очень высокой контрастностью. Кроме того, поскольку свет проходит через объектив дважды, изображение точки сначала становится более резким, а также улучшается разрешение микроскопа.
7. Функция оптической локализации.
В конфокальной оптической системе отраженный свет от части, отличной от фокальной точки, экранируется микропорами. Поэтому при наблюдении трехмерного образца формируется изображение, подобное тому, которое формируется после разрезания образца фокусом (рис. 5). Этот эффект называется оптической локализацией и относится к одной из особенностей конфокальной оптической системы.
8. Функция фокусировки движущейся памяти
Так называемый отраженный свет за пределами фокуса экранируется микропорами. С другой стороны, можно считать, что все точки изображения, формируемого конфокальной оптической системой, совпадают с фокусом. Следовательно, если трехмерный образец перемещать по направлению оси Z (оптической оси), изображение будет накапливаться и сохраняться в памяти, и в конечном итоге zui получит изображение, сформированное совпадением всего образца и фокуса. . Таким образом, функция бесконечной глубины фокуса называется функцией мобильной памяти.
9. Функция измерения формы поверхности.
С помощью функции перемещения фокуса форму поверхности образца можно измерить бесконтактным способом, добавив петлю регистрации высоты. На основе этой функции можно записать координаты оси Z, образованные большим значением яркости zui в каждом пикселе, и на основе этой информации можно получить информацию, связанную с формой поверхности образца.
10. Высокоточная функция измерения микроразмеров.
В блоке приема света используется одномерный ПЗС-датчик изображения, поэтому на него не влияет наклон сканирования сканирующего устройства, что позволяет выполнить высокоточные измерения. Кроме того, поскольку одновременно используется функция памяти перемещения фокуса с регулируемой глубиной фокуса, можно устранить ошибку измерения, вызванную смещением фокуса.
11. Анализ трехмерного изображения
Используя функцию измерения формы поверхности, можно легко создать трехмерное изображение поверхности образца. Не только это, но также можно выполнить многие виды анализа, такие как: измерение шероховатости поверхности, площади, объема, площади поверхности, округлости, радиуса, длины зуи, периметра, центра тяжести, томографического изображения, преобразования БПФ, линии. измерение ширины и так далее.
Лазерный конфокальный сканирующий микроскоп можно использовать не только для наблюдения за морфологией клеток, но и для количественного анализа биохимических компонентов в клетках, статистики оптической плотности и измерения морфологии клеток.
