Знание конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии: для облучения образца используется точечный источник света, образующий небольшую, четко выраженную световую точку в фокальной плоскости; флуоресценция, излучаемая из этой точки после облучения, собирается объективом и отправляется обратно по первоначальному пути облучения к светоделителю, состоящему из двунаправленного хроматического зеркала. Делитель луча направляет флуоресценцию непосредственно на детектор. И источник света, и детектор имеют перед собой точечное отверстие, называемое точечным отверстием освещения и точечным отверстием обнаружения соответственно. Оба имеют одинаковую геометрию, около 100-200 нм, и сопряжены относительно точки света на фокальной плоскости, т. е. точка света проходит через ряд линз и в конечном итоге может быть сфокусирована как на освещающей и детекторные отверстия. Таким образом, свет из фокальной плоскости может сходиться внутри апертуры зонда, тогда как рассеянный свет сверху или снизу фокальной плоскости блокируется за пределами апертуры зонда и не может быть отображен. Лазер сканирует образец точка за точкой, а фотоумножитель после обнаружения точечного отверстия также получает конфокальное изображение соответствующей световой точки точка за точкой, которое преобразуется в цифровой сигнал и передается на компьютер и, наконец, сходится в четкое изображение. конфокальное изображение всей фокальной плоскости на экране.
Каждое изображение в фокальной плоскости фактически представляет собой оптическое сечение образца, и это оптическое сечение всегда имеет определенную толщину, также известную как оптический лист. Поскольку интенсивность света в фокальной точке намного больше, чем в нефокальной точке, а свет нефокальной плоскости отфильтровывается точечным отверстием, глубина резкости конфокальной системы приближается к нулю, и сканирование вдоль направления оси Z позволяет оптической томографии формировать двумерный оптический срез образца, который можно наблюдать в фокальном пятне. Сочетая сканирование плоскости XY (фокальной плоскости) со сканированием по оси Z (оптической оси), трехмерное изображение образца можно получить путем накопления последовательных слоев двухмерных изображений, которые обрабатываются специализированным компьютерным программным обеспечением.
Это означает, что точечное отверстие обнаружения и отверстие источника света всегда фокусируются в одной и той же точке, так что флуоресценция, возбужденная за пределами фокальной плоскости, не может проникнуть в точечное отверстие обнаружения.
Принцип работы лазерного конфокального устройства просто выражается в том, что он использует лазер в качестве источника света на основе традиционного флуоресцентного микроскопа, дополнительного устройства лазерного сканирования и сопряженного фокусирующего устройства, посредством компьютерного управления для выполнения системы получения и обработки цифровых изображений.
