Определение количества микроорганизмов - прямой метод подсчета под микроскопом!
Рост популяции бактерий проявляется увеличением числа клеток или увеличением клеточной массы. Методы определения количества клеток включают метод прямого подсчета под микроскопом, метод подсчета колоний на чашках, метод фотоэлектрического коэффициента масла, метод максимальной вероятности и метод мембранной фильтрации. Методы измерения клеточного вещества включают определение сухого веса клеток, определение определенных клеточных компонентов, таких как содержание азота, РНК и ДНК, и определение метаболитов. Короче говоря, существует множество методов измерения роста микроорганизмов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, и их следует выбирать в зависимости от конкретной ситуации. Этот эксперимент в основном знакомит с методом прямого подсчета с помощью микроскопа, обычно используемым в производстве и научных исследованиях.
1. Целевые требования
1. Уточнить принцип подсчета клеток крови.
2. Освоить методику подсчета микроорганизмов с помощью счетчика клеток крови.
2. Основные принципы
Метод прямого подсчета микроскопа — это простой, быстрый и интуитивно понятный метод прямого подсчета небольшого количества суспензии тестируемого образца на специальном предметном стекле определенной площади и объема (также известный как счетчик бактерий). Методы. В настоящее время широко используемыми счетчиками бактерий в стране и за рубежом являются: доска для подсчета клеток крови, счетчик бактерий Петероффа-Хаузера, счетчик бактерий Хоксли и т. Д. Их можно использовать для подсчета дрожжей, бактерий, спор плесени и других суспензий. основной принцип тот же. Последние два типа счетчиков бактерий имеют общий объем 0.02 мм3 после покрытия покровным стеклом, а расстояние между покровным стеклом и предметным стеклом составляет всего 0,02 мм, поэтому масло Иммерсионный объектив можно использовать для наблюдения и наблюдения за небольшими клетками, такими как бактерии. считать. Помимо этих бактериометров существует также метод оценки отношения площади мазка к площади поля зрения, наблюдаемого непосредственно под микроскопом, который обычно применяют при бактериологическом исследовании молока. К преимуществам метода прямого подсчета микроскопа относятся интуитивность, быстрота и простота в эксплуатации. Однако недостатком этого метода является то, что измеряемый результат обычно представляет собой сумму мертвых и живых клеток. В настоящее время существуют некоторые методы преодоления этого недостатка, такие как сочетание окрашивания жизнеспособных бактерий в микрокамерной культуре (короткое время) и добавление ингибиторов клеточного деления для достижения цели подсчета только жизнеспособных бактерий.
В этом эксперименте в качестве примера для прямого микроскопического подсчета использовали гемоцитометр. Для использования других двух типов счетчиков бактерий обратитесь к инструкциям каждого производителя. Подсчет непосредственно под микроскопом с помощью гемоцитометра является широко используемым методом подсчета микроорганизмов. Счетная пластинка представляет собой специальное предметное стекло, на котором четырьмя прорезями образованы три площадки; более широкая платформа посередине разделена на две половины короткой поперечной прорезью, а с каждой стороны платформы имеется сетка. Каждая сетка разделена на девять больших квадратов, а большой квадрат посередине — это счетная комната. Структура планшета для подсчета клеток крови показана на рисунке l{{{{10}}}}. Шкала счетной комнаты обычно имеет две характеристики: одна представляет собой большой квадрат, разделенный на 25 средних квадратов, и каждый средний квадрат разделен на 16 маленьких квадратов (рис. 15-2); другой большой квадрат. Квадрат делится на 16 средних квадратов, а каждый средний квадрат делится на 25 маленьких квадратов, но какая бы счетная доска ни была, в каждом большом квадрате 400 маленьких квадратов. Длина стороны каждого большого квадрата равна 1 мм, а площадь каждого большого квадрата равна 1 мм2. После покрытия покровным стеклом высота между покровным и предметным стеклами составляет 0,1 мм, поэтому объем счетной камеры составляет 0,1 мм3 (одна тысячная миллилитра). Рисунок 15-1 Структура доски для подсчета клеток крови (1) Рисунок 15-2 Структура доски для подсчета клеток крови (2) A. Вид спереди; B. Вид в продольном разрезе; Увеличенная сетка, большой квадрат посередине – счетная камера 1. Планшет для подсчета клеток крови; 2. Защитное стекло; 3. При подсчете в счетной камере обычно подсчитывают общее количество бактерий в пяти квадратах, затем вычисляют среднее значение для каждого квадрата и умножают на 25 или 16, чтобы получить общее количество бактерий в большом квадрате затем преобразуется в общее количество бактерий в 1 мл бактериального раствора. Пусть общее количество бактерий в пяти квадратах равно A, а коэффициент разбавления бактериального раствора равен B. Если это счетная чашка с 25 квадратами, общее количество бактерий в 1 мл бактериального раствора {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(кусочки) Аналогично, если это счетная чашка с 16 средними квадратами, общее количество бактерий в 1 мл бактериального раствора=A/ 5×16×104×B=32000A·B (шт.)
3. Оборудование
1. Бактерии
сахаромицеты церевисиае
2. Инструменты или другая посуда
Гемоцитометр, микроскоп, покровное стекло, стерильная капиллярная капельница.
4. Этапы работы
1. Приготовление бактериальной суспензии
Saccharomyces cerevisiae готовили в виде бактериальной суспензии соответствующей концентрации со стерильным физиологическим раствором.
2. Комната подсчета микроскопов
Перед добавлением образцов осмотрите под микроскопом счетную камеру счетной пластины. Если есть грязь, ее нужно очистить и высушить перед подсчетом.
3. Добавьте образец
Накройте чистый и сухой гемоцитометр покровным стеклом, а затем используйте стерильную капиллярную пипетку, чтобы капнуть небольшую каплю встряхнутой суспензии Saccharomyces cerevisiae с края покровного стекла, и пусть бактериальный раствор автоматически переместится вдоль щели за счет капиллярного осмоса. Войдя в счетную комнату, общую счетную комнату можно заполнить бактериальной жидкостью. При отборе проб сначала встряхните бактериальный раствор; при добавлении проб в счетной камере не должно образовываться пузырьков воздуха.
4. Подсчет микроскопа
После добавления образца постойте еще 5 минут, затем поместите гемоцитометр на предметный столик микроскопа, сначала найдите расположение счетной камеры с помощью микроскопа с малым увеличением, а затем переключитесь на микроскоп с большим увеличением для подсчета. Отрегулируйте интенсивность света микроскопа соответствующим образом. Для микроскопов, в которых для освещения используются зеркала, обратите внимание на то, чтобы не отклоняться от одной стороны света, иначе будет непросто четко увидеть квадратные линии счетной комнаты в поле зрения, либо будут видны только вертикальные или горизонтальные линии. увидимся. Если перед подсчетом обнаруживается, что бактериальный раствор слишком концентрирован или слишком разбавлен, перед подсчетом необходимо отрегулировать разведение. Как правило, для разбавления образца требуется от 5 до 10 бактерий в каждой маленькой ячейке. Каждая счетная камера выбирает для подсчета 5 средних ячеек (факультативно 4 угловых и одну среднюю ячейку в центре). Ячейки, расположенные на линии сетки, обычно учитываются только на верхней и правой линиях. В случае почкования дрожжей, когда размер почки достигает половины материнской клетки, ее считают за две бактериальные клетки. Чтобы подсчитать образец, рассчитайте содержание бактерий в образце, рассчитав среднее значение из двух счетных камер.
5. Промойте количество клеток крови
После использования промойте доску для подсчета клеток крови под краном, не трите твердыми предметами и высушите ее самостоятельно или феном после мытья. Микроскопическое исследование, чтобы увидеть, есть ли остаточные бактерии или другие отложения в каждой маленькой клетке. Если он не чистый, его необходимо мыть несколько раз, пока он не станет чистым.
