Прямой подсчет микроорганизмов с помощью микроскопа
Экспериментальный принцип
Прямой подсчет микроорганизмов под микроскопом с использованием гемоцитометра является широко используемым методом подсчета микроорганизмов. Преимущество этого метода в том, что он интуитивно понятен и быстр. Поместите соответствующим образом разведенную бактериальную суспензию (или суспензию спор) в счетную камеру между предметным стеклом и покровным стеклом гемоцитометра и подсчитайте под микроскопом. Поскольку объем счетной камеры фиксирован (0.1 мм2), его можно преобразовать в общее количество микроорганизмов в единице объема в соответствии с количеством микроорганизмов, наблюдаемых под микроскопом. Поскольку этот метод подсчитывает сумму живых и мертвых бактерий, его также называют методом общего подсчета бактерий.
Гемоцитометр обычно представляет собой специальное предметное стекло, на котором четыре бороздки образуют три платформы. Платформа посередине разделена на две половины коротким горизонтальным желобом. На платформе с каждой стороны выгравирована сетка. Каждая сетка разделена на девять больших квадратов. Большая площадь посередине — это счетная комната. Микроорганизмы подсчитывают в счетной камере. Структура доски для подсчета клеток крови показана на рисунке Ⅷ-1.
Масштаб счетной комнаты обычно имеет две характеристики: одна состоит в том, что большой квадрат разделен на 16 средних квадратов, а каждый средний квадрат разделен на 25 маленьких квадратов (рис. Ⅷ-2); другой - большой квадрат. Квадрат разделен на 25 средних квадратов, а каждый средний квадрат разделен на 16 маленьких квадратов (рис. Ⅷ-1, C). Но какая бы счетная доска ни была, количество маленьких квадратов в каждом большом квадрате одинаково, то есть 16×25=400 маленьких квадратов, как показано на рисунке Ⅷ-2.
Длина стороны каждого большого квадрата равна 1 мм, а площадь каждого большого квадрата — 1 мм2. После закрытия покровного стекла высота между предметным стеклом и покровным стеклом составляет 0,1 мм, поэтому объем счетной камеры составляет 0,1 мм3.
При подсчете обычно подсчитывают общее количество бактерий в пяти средних сетках, затем получают среднее значение каждой средней сетки, а затем умножают на 16 или 25, чтобы получить общее количество бактерий в большой сетке, а затем преобразуют в общее количество бактерий в 1 мл бактериального раствора.
Лабораторное оборудование
Гемоцитометр, микроскоп, покровное стекло, стерильный капилляр;
Экспериментальные материалы
Суспензия Saccharomyces cerevisiae
Методика эксперимента (метод прямого счета микробного микроскопа)
1. разбавление
Тщательно разведите суспензию Saccharomyces cerevisiae. Если бактериальный раствор не густой, его не нужно разбавлять.
2. Комната микроскопического счета.
Перед добавлением образцов проводят микроскопический осмотр счетной камеры счетной пластины. Если есть грязь, ее нужно очистить перед подсчетом.
3. добавить образец
Накройте чистый и сухой планшет гемоцитометра покровным стеклом, а затем с помощью стерильной пипетки с тонким горлышком капните небольшую каплю разбавленного раствора Saccharomyces cerevisiae с края покровного стекла (не слишком много), чтобы раствор бактерий находится близко к зазору вдоль зазора. Капиллярный осмос сам поступает в счетную камеру, а общая счетная камера может быть заполнена бактериальной жидкостью. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки воздуха.
4. счет микроскопа
Отдохнув в течение 5 минут, поместите гемоцитометр на столик микроскопа, сначала используйте линзу с малым увеличением, чтобы найти расположение счетной камеры, а затем переключитесь на линзу с большим увеличением для подсчета. Если перед подсчетом обнаруживается, что бактериальный раствор слишком густой или слишком жидкий, необходимо перед подсчетом повторно отрегулировать разведение. Обычно для разведения образца требуется около 5-10 бактерий в каждой ячейке. Каждая счетная камера отбирает бактерии для подсчета в 5 средних сетках (дополнительно 4 угловых и центральных сетках). Бактерии на линии сетки обычно подсчитываются только на верхней и правой линиях. В случае почкования дрожжей, когда размеры тела почки достигают половины материнской клетки, отсчитывают две бактерии. Подсчитайте образец, чтобы рассчитать содержание бактерий в образце на основе значений, подсчитанных в двух счетных камерах.
5. Очистка гемоцитометра
После использования промойте пластину для подсчета клеток крови на кране струей воды, не мойте ее твердыми предметами и после мытья высушите самостоятельно или феном. При микроскопическом исследовании наблюдают, есть ли в каждой клетке остаточные бактерии или другие осадки. Если он грязный, его необходимо промыть несколько раз, пока он не станет чистым.
