Знание флуоресцентного микроскопа
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии: для облучения образца используется точечный источник света, при этом в фокальной плоскости формируется четко очерченное небольшое световое пятно. состоит из разветвителей. Светоделитель направляет флуоресценцию непосредственно на детектор. Перед источником света и детектором имеется отверстие, называемое соответственно отверстием для освещения и отверстием для обнаружения. Геометрический размер обоих одинаковый, около 100-200 нм; относительно светового пятна в фокальной плоскости они сопряжены, то есть световое пятно проходит через ряд линз и, наконец, может одновременно фокусироваться на точечном отверстии освещения и точечном отверстии обнаружения. Таким образом, свет из фокальной плоскости может быть собран в пределах отверстия обнаружения, в то время как рассеянный свет сверху или снизу фокальной плоскости блокируется за пределами отверстия обнаружения и не может быть отображен. Лазер сканирует образец точка за точкой, а фотоумножитель после обнаружения отверстия также получает конфокальное изображение соответствующей точки света точка за точкой, которое преобразуется в цифровой сигнал и передается на компьютер, и, наконец, агрегируется в четкое изображение. конфокальное изображение всей фокальной плоскости на экране.
Каждое изображение в фокальной плоскости на самом деле является оптическим поперечным сечением образца, и это оптическое сечение всегда имеет определенную толщину, также известную как оптический тонкий шлиф. Поскольку интенсивность света в фокальной точке намного больше, чем в нефокусной, а свет нефокальной плоскости фильтруется точечной диафрагмой, глубина резкости конфокальной системы приблизительно равна нулю, а сканирование по оси Z -оси можно реализовать оптическую томографию, формируя наблюдательный двухмерный оптический срез в сфокусированном пятне образца. Сочетая сканирование в плоскости XY (фокальной плоскости) со сканированием по оси Z (оптической оси), можно получить трехмерное изображение образца путем накопления двумерных изображений непрерывных слоев и обработки с помощью специального компьютерного программного обеспечения.
То есть отверстие для обнаружения и отверстие для источника света всегда фокусируются в одной и той же точке, так что флуоресценция, возбуждаемая вне фокальной плоскости, не может попасть в отверстие для обнаружения.
Простым выражением принципа работы лазерного конфокала является то, что он использует лазерный свет в качестве источника света. На основе традиционной визуализации флуоресцентного микроскопа он добавляет лазерное сканирующее устройство и сопряженное фокусирующее устройство, а также представляет собой систему для получения и обработки цифровых изображений с помощью компьютерного управления.
