Чем флуоресцентная микроскопия отличается от обычной микроскопии
Недавно я попытался сделать несколько замороженных срезов мышей, и теперь мне нужно использовать флуоресцентный микроскоп, чтобы проверить, находится ли введенный мной вирус в нужной области мозга. Некоторые основные принципы флуоресцентной микроскопии необходимо кратко изучить, и я также поделюсь ими здесь.
Флуоресцентный микроскоп использует ультрафиолетовый свет в качестве источника света для освещения испытуемого объекта, заставляя объект излучать источник света, а затем наблюдать объект под микроскопом. В основном используемый для иммунофлуоресцентных клеток, он состоит из источника света, системы фильтрующих пластин и оптической системы для наблюдения флуоресцентного изображения образца посредством увеличения окуляра и объектива. Давайте посмотрим, чем отличается этот флуоресцентный микроскоп от обычного оптического микроскопа.
1. С точки зрения способов освещения
В методе освещения флуоресцентного микроскопа обычно используется метод падающего луча, что означает, что источник света проецируется на исследуемый образец через линзу объектива.
2. По разрешению
Флуоресцентная микроскопия использует ультрафиолетовый свет в качестве источника света с относительно короткой длиной волны, но более высоким разрешением, чем у обычных оптических микроскопов.
3. Отличия по фильтру
Флуоресцентный микроскоп использует два специальных фильтра: один перед источником света для фильтрации видимого света, а другой между объективом и окуляром для фильтрации ультрафиолетового света, который может защитить глаза.
Флуоресцентная микроскопия также является разновидностью оптического микроскопа, главным образом потому, что длина волны, возбуждаемая флуоресцентной микроскопией, коротка, что приводит к различиям в структуре и использовании флуоресцентной микроскопии и обычной микроскопии. Большинство флуоресцентных микроскопов хорошо улавливают слабый свет, поэтому их способность получать изображения также хороша при чрезвычайно слабой флуоресценции. Кроме того, благодаря постоянному совершенствованию флуоресцентной микроскопии в последние годы шум также был значительно снижен. Поэтому применяется все больше и больше флуоресцентных микроскопов.
Знания, связанные с двухфотонной флуоресцентной микроскопией.
Основной принцип двухфотонного возбуждения заключается в том, что при высокой плотности фотонов флуоресцентные молекулы могут одновременно поглощать два длинноволновых фотона и после короткого периода времени так называемого возбужденного состояния испускать фотон с более короткой длиной волны; Его эффект аналогичен использованию фотона с длиной волны, равной половине длинной волны, для возбуждения флуоресцентных молекул. Двухфотонное возбуждение требует высокой плотности фотонов, и чтобы избежать повреждения клеток, в двухфотонном микроскопе используется высокоэнергетический импульсный лазер с синхронизацией мод. Лазер, излучаемый лазером этого типа, имеет высокую пиковую энергию и низкую среднюю энергию, ширину импульса всего 100 фемтосекунд и частоту от 80 до 100 МГц. При использовании объектива с высокой числовой апертурой для фокусировки фотонов импульсного лазера плотность фотонов в фокусе объектива самая высокая, а двухфотонное возбуждение происходит только в фокусе объектива. Таким образом, двухфотонный микроскоп не требует конфокальных отверстий, что повышает эффективность обнаружения флуоресценции.
В общих явлениях флуоресценции из-за низкой плотности фотонов возбуждения флуоресцентная молекула может поглощать только один фотон одновременно, а затем излучать один флуоресцентный фотон посредством радиационного перехода, который называется однофотонной флуоресценцией. В процессе возбуждения флуоресценции с использованием лазера в качестве источника света могут возникать явления двухфотонной или даже многофотонной флуоресценции. В это время используемый источник возбуждающего света имеет высокую интенсивность, а плотность фотонов соответствует требованию, чтобы флуоресцентные молекулы поглощали два фотона одновременно. В процессе использования типичного лазера в качестве источника возбуждающего света плотность фотонов все еще недостаточна для создания явления двухфотонного поглощения. Обычно используются фемтосекундные импульсные лазеры, мгновенная мощность которых может достигать уровня мегаватт. Следовательно, длина волны двухфотонной флуоресценции короче, чем длина волны возбуждения, что эквивалентно эффекту, вызываемому возбуждением на половинной длине волны.
