Как можно наблюдать морфологию микробных клеток под микроскопом?
Микроскопы были изобретены, чтобы видеть улыбающиеся объекты, которые невозможно увидеть невооруженным глазом. Микроорганизмы очень малы, поэтому их необходимо увеличивать и наблюдать с помощью микроскопа. Кроме того, существует множество видов микроорганизмов, поэтому большинство оптических микроскопов позволяют наблюдать микроорганизмы. Следующий вопрос – какой тип микроскопа следует использовать для наблюдения и анализа каких микроорганизмов. Обычные микроскопы, которые можно использовать для наблюдения за морфологией микробов, включают биологические микроскопы, фазово-контрастные микроскопы, инвертированные микроскопы, флуоресцентные микроскопы, конфокальные микроскопы и т. д.
Ниже описаны различные микроскопы, используемые для наблюдения за микроорганизмами:
1. Обычный оптический микроскоп использует естественный свет или свет в качестве источника света, а его длина волны составляет около 0,4 мкм. Разрешение микроскопа составляет половину длины волны, то есть 0,2 мкм, а наименьшее изображение, видимое невооруженным глазом, составляет 0,2 мм. Следовательно, использование масляного (иммерсионного) зеркала для увеличения в 1000 раз может увеличить частицы размером 0,2 мкм до размеров 0,2 мм, видимых невооруженным глазом. Для наблюдения за бактериями, актиномицетами и грибами можно использовать обычные оптические микроскопы.
2. Темнопольная микроскопия обычно используется для наблюдения за морфологией и движением неокрашенных микроорганизмов. После установки конденсора темного поля в обычный микроскоп свет не может проникать прямо из середины, и поле зрения становится темным. Когда на образец попадает косой свет от края конденсора, он может рассеиваться, поэтому на темном фоне можно наблюдать яркие микроорганизмы, такие как бактерии или спирохеты.
3. Фазово-контрастный микроскоп. Фазово-контрастный микроскоп использует световой эффект фазоразностной пластины для изменения фазы света и амплитуды прямого света, а также преобразования разницы фаз света в разницу интенсивности света. Под фазово-контрастным микроскопом при прохождении света через неокрашенный препарат различие световой фазы обусловлено несоответствием плотности различных частей препарата и можно наблюдать морфологию, внутреннее строение и способ движения микроорганизмов.
4. Флуоресцентный микроскоп. Флуоресцентный микроскоп по своей сути аналогичен обычному оптическому микроскопу, основным отличием является источник света, фильтр и конденсатор. В настоящее время в большинстве из них используются эписветовые устройства, а в качестве источников света широко используются ртутные лампы высокого давления, способные излучать ультрафиолетовый или сине-фиолетовый свет. Существует два типа фильтров: фильтр возбуждения и фильтр поглощения. В дополнение к обычным конденсаторам светлого поля в флуоресцентных микроскопах также можно использовать конденсаторы темного поля, использующие синий свет для усиления контраста между флуоресценцией и фоном. Этот метод применим для обнаружения или идентификации бактерий, окрашенных флуоресцентными пигментами или в сочетании с флуоресцентными антителами.
5. Электронные микроскопы используют поток электронов в качестве источника света, а длина волны в десятки тысяч раз отличается от видимого света, что значительно улучшает разрешение. Он также использует магнитную катушку в качестве системы оптического усиления, а увеличение может достигать десятков тысяч или сотен тысяч раз. Его часто используют для наблюдения за вирусными частицами и ультраструктурой бактерий.
Наблюдение за неокрашенными микробными образцами:
Неокрашенные образцы обычно можно использовать для наблюдения за морфологией, силой и движением бактерий. Бактерии бесцветны и прозрачны в неокрашенном виде и наблюдаются под микроскопом главным образом по разнице между показателем преломления бактерий и окружающей среды. Бактерии со жгутиками двигаются энергично, тогда как бактерии без жгутиков демонстрируют нерегулярное броуновское движение. Жизнеспособные бактерии, такие как Treponema pallidum, Leptospira и Campylobacter, имеют характерную форму и характер движения, которые имеют диагностическое значение. Обычно используемыми методами являются метод падения давления, метод подвесного падения и капиллярный метод.
1. Нанесите вазелин вокруг вогнутого отверстия чистого вогнутого стекла методом подвешивания капли, используйте инокуляционную петлю, чтобы взять кольцо бактериальной суспензии и поместить его в центр покровного стекла, затем совместите вогнутое отверстие вогнутого стекла с каплю в центр покровного стекла и накройте его, затем быстро переверните, слегка прижмите покровное стекло, чтобы оно плотно прилипло к вазелину на краю вогнутого отверстия, и наблюдайте под микроскопом с большим увеличением (или темное поле).
2. Возьмите кольцо бактериальной суспензии с инокуляционной петлей и методом перепада давления поместите его в центр чистого предметного стекла и аккуратно накройте бактериальную суспензию покровным стеклом, стараясь не допускать появления пузырьков и перелива бактериальной суспензии. . Постояв несколько секунд неподвижно, наблюдайте под мощным микроскопом в светлом (или темном поле).
3. Капиллярный метод в основном используется для изучения кинетики анаэробных бактерий. Обычно выбирают длину 60~70 мм. После перекачивания суспензии анаэробных бактерий через капилляр с отверстием 0,5-1,0 мм запечатывают два конца капилляра пламенем. Капилляр фиксировали на предметном стекле пластиковой бумагой и наблюдали под мощной линзой в темном поле.
Наблюдение окрашенных микробных препаратов под микроскопом:
После окрашивания бактериального образца из-за резкого контраста цвета между бактериями и окружающей средой морфологические характеристики бактерий (такие как размер, форма, расположение и т. д.) бактерий и некоторых специальных структур (таких как (капсулы, жгутики, споры и т. д.) можно четко наблюдать под обычным оптическим микроскопом, а бактерии можно классифицировать и идентифицировать в соответствии с реактивностью окрашивания.
(1) Общая процедура бактериальной окраски Общая процедура бактериальной окраски следующая: мазок (высушивание) – фиксация – окрашивание.
1. Мазок. Приготовление крови, секрета, экскрементов, пункционной жидкости и жидкой культуры, а также нанесение прямых тонких пленочных мазков на предметные стекла; при вскрытии или заражении тканей животного, для взятия проб смазать место поражения ватным тампоном. Для приготовления бактериальных колоний или газонов на твердой среде сначала используйте инокуляционную петлю, возьмите кольцо физиологического раствора и поместите его в центр предметного стекла, затем используйте стерильную инокуляционную петлю, чтобы взять небольшое количество культуры и измельчить. Равномерно распределите его в физиологическом растворе, распределите на покрытую поверхность площадью 1 см2 и дайте высохнуть естественным путем при комнатной температуре или медленно высохнуть на расстоянии.
2. Целью фиксации является уничтожение бактерий, коагуляция бактериального белка и структуры, а также облегчение окрашивания; способствовать прилипанию бактерий к предметному стеклу во избежание их смывания водой во время промывания; изменяют проницаемость бактерий для красителей, что благоприятствует окрашиванию бактериальных внутриклеточных структур. Обычно его фиксируют нагреванием пламенем, при этом высушенный мазок быстро пропускают через пламя 3 раза. Кожу на тыльной стороне руки при соприкосновении с затвором лучше не обжигать.
3. Крашение В соответствии с различными целями проверки выбирайте разные методы окрашивания. При окрашивании добавляйте раствор красителя по каплям, чтобы увеличить укрывистость.
4. Протрава Любое вещество, способное усиливать сродство красителя к окрашиваемому предмету, фиксировать краситель на окрашенном предмете и вызывать изменение проницаемости клеточной мембраны, называется протравой. Обычно используются квасцы, дубильная кислота, соли металлов, йод и т. д., а для усиления окраски также используется нагревание. Протравы можно использовать между первичным окрашиванием и контрастным окрашиванием, а также можно использовать после фиксации или содержать в составе фиксатора и окрашивания.
5. Обесцвечивание Любой химический агент, который может удалить цвет окрашенного объекта, называется обесцвечивателем. Этанол, ацетон и т. д. обычно используются в качестве обесцвечивателей. Обесцвечивающий агент позволяет определить степень стабильности комбинации бактерий и красителей, что можно использовать для дифференцированного окрашивания.
6. Контрастирование. Обесцвеченные бактерии или их структуры часто докрашивают раствором для контрастного окрашивания для облегчения наблюдения. Цвет раствора для контрастного окрашивания отличается от цвета основного красящего раствора, образуя резкий контраст. Контрастирование не должно быть слишком сильным, чтобы не перекрыть цвет первоначального окрашивания.
