Что вы знаете о флуоресцентной микроскопии?
В флуоресцентных микроскопах в качестве источников возбуждающего света обычно используются ртутные лампы высокой интенсивности. Фильтры используются для фильтрации нежелательного света, оставляя только чистый свет высокой интенсивности, который возбуждает флуорофор. После того, как монохроматический свет облучает образец через линзу объектива, образец возбуждается, излучая свет (флуоресценция), и как флуоресценция, так и свет возбуждения возвращаются по оптическому пути линзы объектива. В этом случае для фильтрации возбуждающего света требуется дихроичное зеркало. , позволяя видеть только флуоресценцию, которая нам нужна.
Эта флуоресценция достигает окуляра по световому пути микроскопа, а затем попадает в наши глаза, где мы можем видеть флуоресценцию, испускаемую флуорофором.
Предварительная проверка и настройка флуоресцентного микроскопа:
(1) Перед каждым наблюдением флуоресценции необходимо регулярно проверять выравнивание нити накала, фокус оптического пути, апертурную диафрагму и настройки полевой диафрагмы флуоресцентного устройства.
(2) Установлен ли в конвертере требуемый узел фильтра возбуждения/излучения флуоресценции, правильно ли настроена линза объектива флуоресцентного микроскопа, а также удалены ли масляные пятна и пыль на передней линзе объектива.
(3) Если одновременно ведется фазоконтрастное наблюдение проходящего света, необходимо проверить сопряжение центра конденсора и фазоконтрастного кольца напротив линзы объектива.
(4) Проверьте, не покрыт ли носитель образца (предметное стекло, покровное стекло и другие принадлежности) жидкостью или пылью и находится ли его толщина в пределах откалиброванного диапазона рабочего расстояния линзы объектива. Нарезанный образец не должен быть слишком толстым, предпочтительно менее или равным 10 мкм.
(5) Поскольку источник света содержит ультрафиолетовые лучи, над передней частью предметного столика помещается коричневая светозащитная пластина, чтобы предотвратить повреждение сетчатки ультрафиолетовыми лучами.
(6) Нестабильность напряжения сократит срок службы ртутной лампы высокого давления, а источник питания источника света оснащен стабилизатором напряжения.
(7) Чтобы продлить срок службы ртутной лампы, ее можно выключить через 15 минут после включения; после отключения люминесцентной лампы ртутной лампы необходимо подождать не менее 10 минут, чтобы перезапустить пары ртути, чтобы они остыли и вернулись в исходное состояние, в противном случае это повлияет на срок службы лампы.
Наблюдение за изображением с помощью флуоресцентного микроскопа:
(1) Примерно через 5-10 минут после включения источника флуоресцентного света интенсивность возбуждающего света стабилизируется, и образец загружается для наблюдения; чтобы предотвратить гашение флуоресценции образца, вызванное чрезмерным количеством возбуждающего света в процессе фокусировки и поиска объектов, сначала уменьшите масштаб флуоресцентного микроскопа. Отрегулируйте интенсивность возбуждающего света до умеренной с помощью апертурной диафрагмы или добавьте фильтр ND, регулярно перемещайте предметный столик. После подтверждения зеркального отображения настройте флуоресцентное состояние для съемки и записи.
(2) Коррекция плохого качества изображения. В дополнение к факторам пробоподготовки можно внести следующие необходимые корректировки:
① Исключите светозащитные или светоограничивающие устройства на оптическом пути визуализации, такие как аксессуары DIC, фильтры нейтральной плотности и т. д.
②Повторно отрегулируйте фокус приемника и размер апертурной диафрагмы флуоресцентного микроскопа.
③ Тщательно отрегулируйте кольцо коррекции перепада покрытия объектива флуоресцентного микроскопа.
Точки приложения флуоресцентной микроскопии
Флуоресцентная микроскопия использует визуализацию «актиничной флуоресценции». Если выбранная длина волны возбуждения находится в ближней ультрафиолетовой области (320-400нм), невидимой невооруженным глазом, спектр излучения флуоресценции также короче, чем средняя длина волны обычных световых зеркальных источников света. улучшать. Фотоны высокой энергии сталкиваются с электронами, заставляя электроны переходить из основного состояния в возбужденное состояние. Электроны в возбужденном состоянии очень нестабильны и возвращаются в основное состояние. При этом будет расходоваться часть тепловой энергии и будут излучаться новые фотоны. Новый фотон имеет меньшую энергию, чем первоначальный фотон, и поэтому имеет большую длину волны. Поскольку длина волны нового фотона отличается от длины волны фотона падающего света, два луча света с разными длинами волн разделяются с помощью определенного метода оптической обработки, так что мы видим только испущенные новые фотоны (сигнал флуоресценции), то есть флуоресцентный микроскоп видит флуоресцентные изображения.
