Как выбрать подходящий флуоресцентный микроскоп
Флуоресцентный микроскоп — это стандартное оборудование для микроскопической визуализации в лабораториях и отделениях патологии, которое использует характеристики флуоресценции для наблюдения и визуализации. Он широко используется в различных областях, таких как клеточная биология, нейробиология, ботаника, микробиология, патология, генетика и т. д. Флуоресцентная визуализация обладает преимуществами высокой чувствительности и специфичности, что делает ее очень подходящей для наблюдения за распределением конкретных белков, органелл и т. д. . в тканях и клетках, изучая совместную локализацию и взаимодействия, отслеживая жизненные динамические процессы, такие как изменения концентрации ионов и так далее.
Выбор микроскопов
Флуоресцентные микроскопы в основном делятся на три категории: прямые флуоресцентные микроскопы (подходят для срезов), инвертированные флуоресцентные микроскопы (подходят для живых клеток, а также для срезов) и стереофлуоресцентные микроскопы (подходят для более крупных образцов, таких как растения, рыбки данио (взрослые/ эмбриональный), медака, органы мыши/крысы и т. д.).
Выбор блоков флуоресцентных фильтров
При выборе блоков фильтров следует учитывать не только длины волн возбуждения и излучения флуоресцентных зондов, но также учитывать наличие неспецифического возбуждения и цветовых перекрестных помех для образцов с многоцветной меткой. В эксперименте мы выберем для возбуждения длину волны, максимально близкую к пику возбуждения, а диапазон приема должен включать пик излучения. Пик возбуждения Alexa Fluor 488 составляет 500 нм, а в флуоресцентном микроскопе можно выбрать фильтр возбуждения 480/40. Обычно используемые в флуоресцентной микроскопии блоки флуоресцентных фильтров можно разделить на два типа: длиннопроходные (LP) и полосовые (BP), которые также необходимо выбирать в соответствии с потребностями.
Конфокальный микроскоп
В традиционных наблюдениях флуоресцентной микроскопии из-за перекрытия флуоресцентно-меченых веществ и структур спонтанной флуоресценции они прочно связаны между собой. Однако традиционные объективы падающей флуоресцентной микроскопии не только собирают свет из фокальной плоскости, но также рассеивают свет вверх и вниз по фокальной плоскости, что приводит к значительному снижению разрешения и контрастности изображения.
Конфокальная визуализация обнаруживает только свет, отраженный от плоскости самофокусировки, тем самым решая вышеуказанную проблему. Источник света образует небольшое и тонкое пятно в фокальной плоскости через точечное отверстие, а свет, излучаемый из фокальной плоскости, собирается через объектив. Большая часть флуоресценции, излучаемой точками выше или ниже фокальной плоскости объектива, не может сходиться в точечном отверстии. Через точечное отверстие может пройти только флуоресценция, расположенная в фокальной плоскости, и небольшая часть дефокусированной флуоресценции, в то время как световой луч за пределами фокальной плоскости сходится спереди или позади пластины с точечным отверстием и блокируется от входа в детектор через точечное отверстие. Обнаруженное изображение находится в фокальной плоскости, поэтому качество конечного изображения значительно улучшается.
Благодаря различным преимуществам и практичности лазерной сканирующей конфокальной микроскопии в настоящее время она является незаменимым экспериментальным помощником в области высокоточной клеточной биологии, ботаники и клеточных исследований. В то же время в будущих научно-исследовательских центрах это будет самый основной и основной исследовательский инструмент.
