Улучшенные преимущества лазерной сканирующей многофотонной микроскопии
Лазерная сканирующая многофотонная микроскопия является крупным усовершенствованием оптической микроскопии, главным образом для наблюдения за глубокой структурой живых клеток, фиксированных клеток и тканей, и позволяет получать четкие и резкие многослойные структуры в Z-плоскости, то есть оптические срезы, и может создавать Трёхмерная твёрдая структура образца. В конфокальном микроскопе используется источник лазерного света, который расширяется, чтобы заполнить всю заднюю фокальную плоскость объектива, а затем сходится в очень маленькую точку на фокальной плоскости образца через систему линз объектива. В зависимости от числовой апертуры объектива диаметр самой яркой точки освещения составляет около 0,25 ~ 0,8 мкм, а глубина — около 0,5 ~ 1,5. мкм. Размер конфокального пятна зависит от конструкции микроскопа, длины волны лазера, характеристик объектива, состояния сканирующего блока и природы образца. Полевые микроскопы имеют большой диапазон и глубину освещения, в то время как конфокальные микроскопы имеют освещение, сосредоточенное в фокусе фокальной плоскости. Самым основным преимуществом конфокальной микроскопии является то, что она позволяет выполнять тонкие оптические срезы толстых флуоресцентных образцов (до 50 мкм и более) толщиной от 0,5 до 1,5 мкм. Серию изображений оптических срезов можно получить, перемещая образец вверх и вниз с помощью шагового двигателя по оси Z микроскопа. Получение информации об изображении контролируется в пределах точной плоскости, и на него не влияют сигналы из других мест на образце. После устранения эффекта фоновой флуоресценции и увеличения отношения сигнал/шум контрастность и разрешение конфокальных изображений значительно улучшаются по сравнению с традиционными флуоресцентными изображениями при полевом освещении. Во многих образцах многие сложные структурные компоненты переплетаются, образуя сложные системы, но как только удастся собрать достаточное количество оптических срезов, мы сможем реконструировать их в 3D с помощью программного обеспечения. Этот экспериментальный подход широко использовался в биологических исследованиях для выяснения сложных структурных и функциональных взаимоотношений между клетками и тканями.
