Введение в многофотонную лазерную сканирующую микроскопию: преимущества и недостатки
1. При возбуждении красным или инфракрасным светом рассеяние света мало, а рассеяние мелких частиц обратно пропорционально четвертой степени длины волны.
2. Больше рассеянных фотонов из поперечного сечения изображения можно собрать без необходимости использования точечных отверстий.
3. Пинхолы не могут различать рассеянные фотоны, испускаемые из расфокусированных или фокальных областей, а мультифотоны имеют лучшее соотношение сигнал/шум при глубокой визуализации.
4. Ультрафиолетовый или видимый свет, используемый для однофотонного возбуждения, легко поглощается и ослабляется образцом до того, как луч достигнет фокальной плоскости, что затрудняет возбуждение глубоких слоев.
5. При наблюдении с помощью биологической микроскопии в первую очередь необходимо не повредить активное состояние самого организма, поддерживать циркуляцию воды, концентрацию ионов, кислорода и питательных веществ. В области светового наблюдения как тепловая, так и фотонная энергия должны оставаться в пределах дозы облучения и энергии света, не повреждающих клетки.
6. Многофотонная микроскопия имеет множество преимуществ. С точки зрения трехмерного разрешения, проникновения в глубину, эффективности рассеяния, фонового света, отношения сигнал/шум, управления и т. д., существуют характеристики, которыми предыдущие лазерные микроскопы не обладали или не могут превзойти.
Недостатки многофотонного лазерного сканирующего микроскопа:
1. Только для флуоресцентной визуализации.
2. Если образец содержит хромофоры, способные поглощать возбуждающий свет, образец может подвергнуться тепловому повреждению.
3. Немного снижается разрешение, хотя его можно улучшить за счет одновременного использования конфокальных малых отверстий, но происходит потеря сигнала.
4. Из-за ограничений дорогих сверхбыстрых лазеров стоимость многофотонных сканирующих микроскопов относительно высока.
