Знания о двух-флуоресцентной микроскопии фотонов
Основной принцип двух-фотонного возбуждения заключается в том, что при высокой плотности фотонов флуоресцентные молекулы могут одновременно поглощать два длинноволновых фотона и излучать более коротковолновые фотоны после короткого периода-жизни в так называемом возбужденном состоянии; Эффект такой же, как при использовании фотона с половиной длины волны длинноволновой волны для возбуждения флуоресцентных молекул. Двухфотонное возбуждение требует высокой плотности фотонов, и чтобы избежать повреждения клеток, в двух-фотонной микроскопии используются высокоэнергетические-режимные-лазеры с синхронизированными импульсами. Лазер, излучаемый этим лазером, имеет высокую пиковую энергию и низкую среднюю энергию, ширину импульса всего 100 фемтосекунд и частоту от 80 до 100 мегагерц. При использовании объектива с высокой числовой апертурой для фокусировки фотонов импульсного лазера плотность фотонов в фокусе объектива самая высокая, и двух-фотонное возбуждение происходит только в фокусе объектива. Таким образом, двух-фотонный микроскоп не требует конфокального отверстия, что повышает эффективность обнаружения флуоресценции.
В общих явлениях флуоресценции из-за низкой плотности фотонов возбуждающего света флуоресцентная молекула может поглощать только один фотон за раз, а затем излучать другой флуоресцентный фотон посредством радиационного перехода, который известен как однофотонная флуоресценция. В процессах возбуждения флуоресценции с использованием лазеров в качестве источников света могут возникать явления двух-фотонной или даже многофотонной флуоресценции. В этом случае используемый источник возбуждающего света имеет высокую интенсивность и плотность фотонов, что отвечает требованию, чтобы флуоресцентные молекулы поглощали два фотона одновременно. В процессе использования обычного лазера в качестве источника возбуждающего света плотность фотонов все еще недостаточна для создания явления поглощения двух-фотонов. Обычно используются фемтосекундные импульсные лазеры, мгновенная мощность которых достигает уровня мегаватт. Следовательно, длина волны двухфотонной флуоресценции короче, чем у возбуждающего света, что эквивалентно эффекту, производимому возбуждением на половине длины волны возбуждения.
