Знания, связанные с конфокальной флуоресцентной микроскопией
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии заключается в использовании точечного источника света для облучения образца с образованием четко очерченного небольшого пятна в фокальной плоскости. Флуоресценция, излучаемая пятном после облучения, собирается объективом и отправляется обратно в спектрофотометр, состоящий из двунаправленного цветного зеркала, вдоль первоначального пути облучения. Спектрофотометр посылает флуоресценцию непосредственно на детектор. Перед источником света и детектором имеются два отверстия, называемые соответственно отверстиями для освещения и отверстиями для обнаружения. Геометрические размеры обоих одинаковы, около 100-200 нм; По сравнению со световой точкой в фокальной плоскости они являются сопряженными, что означает, что световая точка проходит через ряд линз и в конечном итоге может фокусироваться как на точечном отверстии освещения, так и на точечном отверстии обнаружения одновременно. Таким образом, свет из фокальной плоскости может сходиться в пределах диапазона детекторного отверстия, в то время как рассеянный свет сверху или снизу фокальной плоскости блокируется за пределами детекторного отверстия и не может быть отображен. Сканируя образец по точкам с помощью лазера, фотоумножитель после обнаружения точечного отверстия также получает соответствующее конфокальное изображение точки за точкой света, которое преобразуется в цифровой сигнал и передается на компьютер. Наконец, на экране синтезируется четкое конфокальное изображение всей фокальной плоскости.
Каждое изображение в фокальной плоскости фактически представляет собой оптическое сечение образца, которое всегда имеет определенную толщину, также известную как оптическое тонкое сечение. В связи с тем, что интенсивность света в фокальной точке намного больше, чем в нефокальной точке, а свет нефокальной плоскости фильтруется точечными отверстиями, глубина резкости конфокальной системы равна примерно нулю. Сканирование в направлении оси Z позволяет добиться оптической томографии, формируя двумерный оптический срез в фокусном пятне наблюдаемого образца. Комбинируя сканирование плоскости XY (фокальной плоскости) со сканированием по оси Z (оптической оси), можно получить трехмерное изображение образца путем накопления непрерывных слоев двухмерных изображений и их обработки с помощью специализированного компьютерного программного обеспечения.
Отверстие для обнаружения и отверстие для источника света всегда фокусируются в одной и той же точке, поэтому флуоресценция, возбуждаемая за пределами плоскости фокусировки, не может попасть в отверстие для обнаружения.
Простое выражение принципа работы лазерной конфокальной микроскопии заключается в том, что она использует лазер в качестве источника света и добавляет устройство лазерного сканирования и сопряженное фокусирующее устройство на основе традиционной визуализации флуоресцентной микроскопии. Это система, управляемая компьютером, для получения и обработки цифровых изображений.
