Особенности и применение лазерного конфокального микроскопа
Если в обычном микроскопе плоскость изображения наблюдения изолирована от соседних осевых плоскостей за счет перекрытия фокальной плоскости объектива с детектором, то в конфокальном микроскопе эта изоляция достигается за счет освещения образца дифракционно-ограниченной точкой свет и фильтрация рассеянного света с помощью точечного отверстия на пути собранного света в сопряженном фокусе этой точки света для достижения этой изоляции и, таким образом, улучшения разрешения.
Только свет, отраженный обратно от сопряженного слоя образца, может пройти через точечное отверстие на пути сбора света, в то время как остальные отражения нерелевантного слоя образца блокируются точечным отверстием. Это дает существенный прирост разрешения. Ниже показано параллельное сравнение многомерной флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии одного и того же толстого образца. Когда делается серия изображений в разных фокальных плоскостях, создается изображение, обычно называемое «z-стеком», которое показывает выигрыш в разрешении и контрасте, обеспечиваемый конфокальной микроскопией, а также основные причины этого выигрыша. Видно, что рассмотрение изображения в верхней части стопки, где плоскость изображения находится над тканью, обнаруживает большое количество рассеянного света на флуоресцентном изображении, тогда как изображение конфокального микроскопа кажется черным. Это уменьшение PSF в осевом направлении напрямую способствует разнице в разрешении, наблюдаемой на оптическом интерфейсе в середине z-стека.
Оптическое сканирование срезов
Еще одной особенностью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии является то, что это метод сканирующей визуализации. Традиционные методы широкопольного освещения освещают весь образец так, что изображение может быть захвачено непосредственно невооруженным глазом или детектором, но LSCM использует один или несколько сфокусированных лучей света для сканирования образца, так что полученное изображение называется оптический срез, как показано на следующей схеме. Разница между традиционным широкопольным освещением и конфокальным освещением с лазерным сканированием показана ниже.
Поэтому практический способ современной конфокальной микроскопии показан на рисунке ниже. Возбуждающий свет лазера проходит через дихроичное зеркало и сканируется через пару зеркал гальванометра в направлении x и y образца, а возбуждение (или отражение) образца проходит через точечное отверстие в ФЭУ. детектором, который должен быть записан, и записанное сканированное изображение реконструируется компьютером для получения фактического изображения образца.
