Лазерная конфокальная микроскопия – особенности и применение
Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM) — это тип микроскопа, разработанный на основе технологии сопряженного фокуса, то есть источник лазерного света, измеряемый образец и детектор находятся в сопряженных положениях друг с другом.
Фундаментальный
В обычном микроскопе плоскость изображения изображения изолирована от соседней осевой плоскости путем совмещения фокальной плоскости объектива с детектором, а в конфокальном микроскопе для освещения образца используется ограниченное дифракцией световое пятно и A точечное отверстие используется на пути собранного света в сопряженном фокусе светового пятна для фильтрации рассеянного света, создания эффекта изоляции и тем самым улучшения разрешения.
Функции визуализации
Оптическое сканирование срезов
Еще одной особенностью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии является то, что это технология сканирующей визуализации. Традиционная технология широкопольного освещения освещает весь образец, поэтому изображение может быть получено непосредственно невооруженным глазом или детектором, но LSCM использует луч или несколько сфокусированных лучей проходят через образец для сканирования и изображения. Полученное изображение называется оптическим срезом. Ниже показана разница между традиционным методом широкопольного освещения и методом конфокального освещения с лазерным сканированием.
Таким образом, реальный метод работы современного конфокального микроскопа показан на рисунке ниже. Возбуждающий свет, излучаемый лазером, проходит через дихроичное зеркало и сканируется в направлении x и y образца через пару гальванометров. Возбуждение (или отражение) образца представляет собой свет, который попадает в детектор ФЭУ через точечное отверстие и записывается, а записанное отсканированное изображение восстанавливается компьютером для восстановления фактического изображения образца.
Генерируйте изображения «z-стека» в разных фокальных плоскостях.
Только свет, отраженный обратно от сопряженного слоя образца, может пройти через небольшое отверстие на пути сбора света, а оставшиеся нерелевантные отражения слоя образца блокируются небольшим отверстием. Это может привести к значительному улучшению разрешения. Параллельное сравнение многомерной флуоресцентной и конфокальной микроскопии одного и того же толстого образца. Когда серия изображений снимается в разных фокальных плоскостях, могут быть созданы изображения, обычно называемые «z-стеками», которые иллюстрируют выигрыш в разрешении и контрасте, обеспечиваемый конфокальной микроскопией, а также основные причины этого выигрыша. Видно, что рассмотрение изображения в верхней части стопки с плоскостью изображения над тканью обнаруживает большое количество рассеянного света на флуоресцентном изображении, тогда как изображение конфокальной микроскопии выглядит черным. Это уменьшение осевого PSF напрямую приводит к разнице в разрешении, наблюдаемой на оптическом интерфейсе в середине z-стека.
Разрешение значительно улучшено по сравнению с широкоугольным освещением.
В флуоресцентной микроскопии интенсивность света, излучаемого из одной точки, описывается функцией рассеяния точки (PSF), а ее структура представляет собой диск Эйри. Разрешение флуоресцентной системы можно описать радиусом диска Эйри, который можно описать формулой. Числовая апертура объектива и длина волны возбуждающего света определяют
