Недорогой флуоресцентный и светлопольный микроскоп
В этом руководстве я расскажу об основных принципах флуоресцентной микроскопии и о том, как построить три различных недорогих флуоресцентных микроскопа. Эти системы обычно стоят тысячи долларов, но недавние усилия облегчили их приобретение. В конструкции, которую я здесь представляю, используются смартфоны, зеркальные фотокамеры и USB-микроскопы. Все эти конструкции также можно использовать в качестве микроскопов открытого поля.
Шаг 1: Обзор флуоресцентной микроскопии
Чтобы понять основные понятия флуоресцентной микроскопии, представьте себе густые леса, деревья, животных, кустарники и другие леса, обитающие в лесу ночью. Если посветить фонариком в лес, то вы увидите все эти сооружения и сложно представить конкретных животных или растения. Предположим, вас интересуют только кусты черники в лесу. Для этого нужно приучить светлячков привлекать только кусты черники, чтобы при взгляде на лес светились только кусты черники. Можно сказать, что вы пометили кусты черники светлячками, чтобы увидеть постройки черники в лесу.
В этой аналогии лес представляет весь образец, куст черники — структуру, которую вы хотите визуализировать (например, определенные клетки или субклеточные органеллы), а светлячки — флуоресцентные соединения. Ситуация со стрельбой одним фонариком без светлячков аналогична ситуации со светлопольным микроскопом.
Следующий шаг — понять основные функции флуоресцентных соединений (также известных как флуорофоры). Флуоресцентные кластеры на самом деле представляют собой небольшие объекты (наноразмеры), предназначенные для соединения определенных структур в образце. Они поглощают свет узкого диапазона длин волн и переизлучают свет другой длины волны. Например, флуоресцентная группа может поглощать синий свет (т.е. флуоресцентная группа возбуждается синим светом), а затем снова излучать зеленый свет. Обычно это суммируется через спектры возбуждения и излучения (как показано на рисунке выше). На этих диаграммах показаны длины волн света, поглощаемого флуорофором, и длины волн света, излучаемого флуорофором.
Конструкция микроскопа очень похожа на конструкцию обычного микроскопа открытого поля, но имеет два основных отличия. Во-первых, свет, освещающий образец, должен иметь длину волны возбужденной флуоресцентной группы (в приведенном выше примере свет синий). Во-вторых, микроскопу нужно только собирать излучаемый свет (зеленый свет), блокируя при этом синий свет. Это связано с тем, что синий свет присутствует повсюду, а зеленый свет исходит только от определенных структур образца. Чтобы блокировать синий свет, в микроскопах обычно имеется так называемый длиннопроходной фильтр, который пропускает зеленый свет без синего. Каждый фильтр длинного пропускания имеет длину волны среза. Если длина волны света больше длины волны отсечки, он может пройти через фильтр. Поэтому и название - «Проход на дальние расстояния». Более короткие волны блокируются.
Шаг 2. Моделирование микроскопа с использованием оптической оптики.
Это дополнительный шаг в разработке основного принципа микроскопа. Нет необходимости строить флуоресцентный микроскоп, поэтому, если вы не хотите углубляться в оптику, можете его пропустить.
Как светлопольные, так и флуоресцентные микроскопы можно моделировать с помощью лучевых оптических устройств. Основная предпосылка лучевой оптики состоит в том, что поведение света аналогично поведению света, распространяющегося от источника света. Осмотрев комнату, вы увидите солнечный свет за окном или свет, исходящий от лампочки. Затем свет поглощается или отражается предметами в комнате. Некоторый отраженный свет заставит его смотреть вам в глаза. Если объект освещен, вы можете представить, что каждая точка объекта излучает свет во всех направлениях (как показано на изображении выше). Хрусталик, как и хрусталик в наших глазах, фокусирует свет в точку, чтобы мы могли видеть объект. Без линзы свет продолжает распространяться наружу и не формирует изображение.
