Недорогой флуоресцентный и светлопольный микроскоп
Флуоресцентная микроскопия – это метод, позволяющий визуализировать
В этом руководстве я расскажу об основах флуоресцентной микроскопии и о том, как построить три разных недорогих флуоресцентных микроскопа. Обычно эти системы стоят тысячи долларов, но в последнее время были предприняты некоторые попытки сделать их более доступными. В конструкциях, которые я представляю здесь, используется смартфон, зеркальная фотокамера и USB-микроскоп. Все эти конструкции также можно использовать в качестве микроскопов светлого поля.
Шаг 1: Обзор флуоресцентной микроскопии
Чтобы понять основные концепции флуоресцентной микроскопии, представьте себе густой лес ночью с деревьями, животными, кустами и другими живыми лесами. Если вы посветите фонарем в лес, вы увидите все эти структуры, и вам будет трудно визуализировать конкретных животных или растения. Предположим, вас интересуют только кусты черники в лесу. Для этого вы приучаете светлячка привлекать только кусты черники, чтобы, когда вы смотрите на лес, светились только кусты черники. Можно сказать, что вы используете светлячков, чтобы отмечать кусты черники, чтобы вы могли видеть структуры черники в лесу.
В этой аналогии лес представляет весь образец, кусты черники — структуры, которые вы хотите визуализировать (например, определенные клетки или субклеточные органеллы), а светлячки — флуоресцентные соединения. Освещение одним только факелом без светлячков похоже на микроскопию светлого поля.
Следующий шаг — понять основную функцию флуоресцентных соединений (также известных как флуорофоры). Флуорофоры на самом деле представляют собой небольшие объекты (наноразмеры), предназначенные для соединения определенных структур в образце. Они поглощают свет узкого диапазона длин волн и повторно излучают свет другой длины волны. Например, флуорофор может поглощать синий свет (т.е. флуорофор возбуждается синим светом), а затем повторно излучать зеленый свет. Обычно это суммируется спектрами возбуждения и излучения (выше). На этих диаграммах показана длина волны света, поглощаемого флуорофором, и длина волны света, излучаемого флуорофором.
Конструкция микроскопа очень похожа на конструкцию обычного светлопольного микроскопа, с двумя основными отличиями. Во-первых, свет, освещающий образец, должен иметь длину волны, возбуждающую флуорофор (в приведенном выше примере свет синий). Во-вторых, микроскопу нужно только собирать излучаемый свет (зеленый свет), блокируя при этом синий свет. Это связано с тем, что синий свет присутствует повсюду, а зеленый свет исходит только от определенных структур образца. Чтобы блокировать синий свет, в микроскопах обычно есть так называемый длиннопроходной фильтр, который пропускает зеленый свет без синего света. Каждый фильтр длинного прохода имеет длину волны среза. Если длина волны света превышает длину волны отсечки, он может пройти через фильтр. Отсюда и название «длинный проход». Более короткие волны блокируются.
Шаг 2. Моделирование микроскопа с помощью оптической оптики.
Это дополнительный шаг к основным принципам конструкции микроскопа. Нет необходимости строить флуоресцентный микроскоп, поэтому его можно пропустить, если не хотите углубляться в оптику.
И светлопольные, и флуоресцентные микроскопы можно моделировать с помощью лучевой оптики. Основная предпосылка лучевой оптики заключается в том, что свет ведет себя аналогично свету, распространяющемуся от источника света. Когда вы осматриваете комнату, вы видите свет солнечного света за окном или лампочки. Затем свет поглощается или отражается предметами в комнате. Часть отраженного света направляется к вашим глазам. Если объект освещен, вы можете представить, что каждая точка объекта излучает свет во всех направлениях (см. выше). Хрусталик, как и хрусталик в наших глазах, фокусирует свет в точку, чтобы мы могли видеть объект. Без линзы свет продолжает распространяться наружу и не формирует изображение.
Так как же нам создать оптические системы, которые увеличивают маленькие объекты? Чтобы понять конструкцию, вам действительно нужно знать только два уравнения: уравнения изображения тонкой линзы и уравнения увеличения:
1/f=1/si + 1/so
М=-си/так
f — фокусное расстояние линзы. Более короткое фокусное расстояние означает, что объектив обладает большей силой фокусировки.
То же самое верно и для расстояния до объекта; расстояние между линзой и объектом (например, деревом).
si – расстояние изображения; расстояние между линзой и местом формирования изображения
М – увеличение; насколько велико изображение относительно объекта. Для микроскопов мы хотим увеличить увеличение.
Полное руководство по уравнению тонкой линзы можно найти в этом видео из Академии Хана. На картинке выше вы можете видеть, что расстояние, на которое объект приближается к объективу, увеличивает расстояние изображения, что увеличивает увеличение. Вертикальная линия с двумя стрелками указывает на объектив.
