Методы увеличения фокусной глубины многофотонных микроскопов
Сочетание двух-лазерного сканирующего микроскопа и индикатора кальция является золотым стандартом для обнаружения нейронных сигналов in vivo. Нейроны в нейронных сетях распределены в трехмерном-пространстве, и для мониторинга динамики их активности требуется способ быстрого повышения скорости объемной визуализации. Однако при использовании сканирующего многофотонного микроскопа с решеткой для получения изображения большого количества изображений, если для достижения более высокого латерального разрешения используется объектив с высокой числовой апертурой (NA), это приведет к меньшей фокусной глубине. Чтобы получить объемное изображение при небольшой глубине фокуса,
Необходимо выполнить сканирование по оси Z- с помощью некоторых средств, визуализируя множество плоскостей путем сканирования каждой фокальной плоскости, что значительно ограничивает скорость визуализации. Если можно пожертвовать информацией осевого изображения и обеспечить объемное сканирование за одно боковое сканирование за счет увеличения глубины фокуса, то есть информация об объеме проецируется на одно 2D-изображение, скорость визуализации может быть значительно улучшена. Это называется визуализацией с расширенной глубиной фокуса (EDF), которая особенно полезна для визуализации разреженных популяционных структур, требующих высокого временного разрешения, например, для функциональной визуализации активности нейронов.
Осевое и поперечное разрешение микроскопа определяются числовой апертурой (NA) объектива. Высокая числовая апертура может максимизировать осевое и латеральное разрешение, а также количество собираемого света; Меньшая числовая апертура приведет к более низкому аксиальному разрешению, т.е. большей глубине фокуса, но в то же время принесет в жертву боковое разрешение и эффективность сбора света. Метод расширения глубины резкости, который будет представлен далее, позволяет достичь этого, сохраняя при этом высокое латеральное разрешение и достаточный световой поток.
Использование пространственных модуляторов света для создания тонких фокусных пучков Бесселя может обеспечить получение изображений EDF, но пространственные модуляторы света громоздки и их трудно использовать в узких пространствах микроскопа; Напротив, модули Бесселя на основе осевых пирамид дешевы и компактны, но могут генерировать только фокусы фиксированной глубины и не подходят для различных экспериментов, требующих непрерывного изменения фокусной глубины. Для решения этой проблемы в 2018 году RONGWEN LU et al. продемонстрировал модуль Бесселя на основе аксикона, в котором только одну линзу необходимо перемещать вдоль оптической оси для непрерывной регулировки осевой длины фокальной точки Бесселя.
Рисунок 1 (а) Схема устройства модуля Бесселя; (б) Функция рассеяния точки была экспериментально измерена, когда D составляла -12 мм, 0 мм и 12 мм соответственно; (c) Зависимость между боковой полной шириной на половине высоты, (d) осевой полной шириной на половине высоты, (e) пиковым сигналом и (f) оптической силой за линзой объектива со смещением L2 D
Устройство модуля формирования фокуса Бесселя переменной длины показано на рисунке 1а. Падающий гауссов пучок принимает форму кругового луча после прохождения через аксикон и линзу L1. Последующая маска с круглой апертурой может блокировать рассеянный свет, вызванный дефектами аксикона, тем самым формируя аксиальное распределение функции рассеяния точки двух-фотонного возбуждения. После этого луч света проецируется на гальванометр линзами L2 и L3, а затем достигает задней фокальной плоскости объектива через линзы L4 и L5.
Эти конструкции аналогичны традиционным модулям на основе пирамиды с той разницей, что, перемещая L2 или L3 вдоль оптической оси, можно плавно регулировать осевую длину фокуса Бесселя. На рисунке 1b показаны функции рассеяния осевой точки для значений D -12 мм, 0 мм и 12 мм с осевой полной шириной на половине высоты 39? м, 24? М и 14? м. Как показано на рисунках 1c-f, перемещение линзы L2 слева направо может непрерывно изменять полную ширину на половине максимума как в поперечном, так и в осевом направлениях, а это означает, что глубину резкости можно постоянно изменять. Результаты численного моделирования на основе векторной теории дифракции хорошо согласуются с экспериментальными данными. На рисунке 2 показано влияние коррекции кольцевых масок разных размеров на дефекты аксиконов. Обнаружено, что более тонкие кольцевые маски позволяют лучше оптимизировать аксиальное распределение интенсивности выходного пучка Бесселя, но в то же время они также приводят к большим потерям мощности.
