Класс микроскопии 丨 Применение флуоресцентной микроскопии
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) — это метод, в котором используется затухающая волна, генерируемая световым лучом, распространяющимся между двумя средами с разными показателями преломления, для исследования поверхности флуоресцентно меченных живых клеток. На практике, когда падающий лазерный луч сталкивается с границей между покровным стеклом и водной средой, содержащей клетки, он отражается под критическим углом (полное внутреннее отражение). Поскольку энергия затухающей волны экспоненциально уменьшается с расстоянием от покровного стекла, только флуорофоры в пределах 10 нанометров от поверхности (между 10 и 200 нанометрами) возбуждаются затухающей волной, в то время как флуорофоры, расположенные дальше, в основном не возбуждаются. Затронутый. Таким образом, TIRFM приводит к высоким уровням сигнала от флуорофоров, расположенных рядом с покровным стеклом, наложенным на очень темный фон, обеспечивая отличное соотношение сигнал/шум. Чрезвычайное ограничение глубины возбуждения идеально подходит для изучения отдельных молекул или состава мембран и органелл в прикрепленных клетках вблизи поверхности покровного стекла (см. Рисунок 8 (e)). Поскольку возбуждение ограничено тонкими областями вблизи покровного стекла, фотообесцвечивание и фототоксичность также ограничены этими областями, что делает TIRFM одним из наиболее полезных методов для долгосрочного наблюдения. Методика стала фундаментальным инструментом для изучения широкого круга явлений клеточной и молекулярной биологии.
Деконволюция — это алгоритм, применяемый к набору изображений со всеми фокусами, полученных вдоль оптической оси (Z), для усиления фотонного сигнала в стопке изображений для данной плоскости изображения или нескольких фокальных плоскостей. Микроскопы должны быть оснащены высокоточными моторизованными приводами фокусировки, чтобы гарантировать получение изображений с точно определенными интервалами между фокальными плоскостями образца. В типичном приложении (см. рис. 8(f)) процесс деконволюции используется для устранения размытия и удаления расфокусированного света из заданной фокальной плоскости с использованием возбуждения и излучения широкопольной флуоресценции. Наиболее сложным приложением является применение процесса деконволюции ко всему стеку изображений для создания проекций или 3D-моделей. Набор широкопольных изображений, используемых для деконволюции, фиксирует теоретическое максимальное количество фотонов, испускаемых образцом. Процесс деконволюции перераспределяет «размытые» интенсивности фотонов, испускаемых выше и ниже фокальной плоскости, обратно в исходную плоскость. Таким образом, деконволюция использует почти все доступные интенсивности излучения и обеспечивает оптимальный световой баланс, что делает этот метод предпочтительным методом для очень светочувствительных образцов.
Вариант явления резонансного переноса энергии при флуоресцентной микроскопии, флуоресценции или резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) используется для получения количественной временной и пространственной информации о связывании и взаимодействии белков, липидов, ферментов и нуклеиновых кислот в живых клетках. FRET может использовать либо методы постоянного состояния, либо методы с временным разрешением, но FRET-визуализация с временным разрешением имеет преимущество более точного картирования донорно-акцепторных расстояний. Для FRET-изображения можно использовать стандартный широкопольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующими фильтрами возбуждения и эмиссии, а также чувствительной камерой. В настоящее время в клеточной биологии широко используются биосенсоры, которые помещают чувствительный к окружающей среде белок или пептид между двумя флуоресцентными белками, применимыми к FRET. Эти зонды легко визуализируются под широкопольной флуоресцентной микроскопией с использованием методов FRET с сенсибилизированной эмиссией в сочетании с логометрическим анализом. Кроме того, спектральная визуализация и линейное разделение с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии могут помочь в мониторинге явлений FRET в биосенсорах и других применениях флуоресцентных белков.
Микроскопия времени жизни флуоресценции (FLIM) представляет собой сложный метод, позволяющий одновременно регистрировать время жизни флуоресценции и пространственное положение флуорофора в каждой точке изображения. Этот метод обеспечивает механизм для изучения параметров окружающей среды, таких как pH, концентрация ионов, полярность растворителя, нековалентные взаимодействия, вязкость и напряжение кислорода в отдельных живых клетках, и представляет данные в пространственных и временных массивах. Измерения FLIM времени жизни в возбужденном состоянии в наносекундном масштабе не зависят от локальных концентраций флуорофора, эффектов фотообесцвечивания и длины пути (толщины образца), но чувствительны к реакциям в возбужденном состоянии, таким как резонансная передача энергии. Фактически, сочетание FLIM с FRET путем наблюдения за изменениями времени жизни флуоресцентных доноров до и после резонансной передачи энергии считается одним из лучших способов изучения этого явления.
Подвижность (коэффициент поперечной диффузии) флуоресцентно меченых макромолекул и малых флуорофоров можно определить с помощью метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). В FRAP очень небольшая выбранная область (диаметром несколько микрометров) интенсивно освещается, обычно лазером, для полного фотообесцвечивания флуорофора в этой области. Результатом является резкое снижение или аннигиляция флуоресценции. После импульса фотообесцвечивания скорость и степень восстановления интенсивности флуоресценции в обесцвеченных областях контролировали в зависимости от времени при низких интенсивностях возбуждения для получения информации о кинетике репопуляции и восстановления флуорофора (рис. 9). FRAP обычно выполняется с использованием EGFP или других флуоресцентных белков. Связанные методы фотоактивации основаны на специальных синтетических флуорофорах в клетке или аналогичных функциональных флуоресцентных белках, которые можно активировать короткими импульсами ультрафиолетового или фиолетового света. Фотоактивацию и FRAP можно использовать в качестве дополнительных методов для определения параметров подвижности.
В методе, связанном с FRAP, называемом потерей флуоресценции после фотообесцвечивания (FLIP), определенная флуоресцентная область в живой клетке подвергается многократному фотообесцвечиванию под действием интенсивного облучения. Если бы все флуорофоры могли диффундировать в область фотообесцвечивания в течение измеряемого периода времени, это привело бы к полной потере флуоресцентного сигнала во всей клетке. Рассчитав скорость исчезновения флуоресценции всей клетки, можно определить диффузионную подвижность целевого флуорофора. Кроме того, FLIP может легко определить местоположение и характер любых диффузионных барьеров между отдельными компартментами клеток, таких как барьер между сомой и аксоном нейрона.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), в основном используемая в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии или многофотонной микроскопии, представляет собой метод, предназначенный для определения кинетической информации, такой как скорость химической реакции, коэффициенты диффузии, методы определения молекулярной массы, скорости потока и агрегации. В FCS небольшой объем (примерно один фемтометр; дифракционно-ограниченный фокус лазера) освещается сфокусированным лазерным лучом для регистрации флуктуаций интенсивности автофлуоресценции, вызванных динамикой флуоресцентных молекул, в зависимости от времени в объеме, занимаемом флуоресцентными молекулами. молекул (рис. 10). Относительно небольшие флуорофоры быстро диффундируют в освещенном объеме, производя короткие вспышки случайной интенсивности. Наоборот, более крупные комплексы (флуорофоры, связанные с макромолекулами) движутся медленнее, производя более длительные, более устойчивые паттерны интенсивности флуоресценции, зависящие от времени.
Когда флуоресцентно меченные структуры плотно упакованы и перекрываются в определенных областях живых клеток, их динамику и пространственное распределение трудно анализировать. Флуоресцентная точечная микроскопия (FSM) — это метод, совместимый почти со всеми методами визуализации, который использует преимущества очень низких концентраций флуоресцентно меченых субъединиц, снижает флуоресценцию вне фокуса и улучшает видимость меченых структур и их динамику в толстых областях. FSM реализуются путем маркировки только части всей интересующей структуры. В этом смысле FSM похож на выполнение FCS по всему полю зрения, хотя в нем больше внимания уделяется пространственным закономерностям, а не количественному временному анализу. Флуоресцентная точечная микроскопия особенно полезна для определения подвижности и агрегации элементов цитоскелета, таких как актин и микротрубочки, в гиперактивных клетках.
Стимулированная эмиссионная микроскопия истощения (STED) — это новый метод сверхвысокого разрешения с пространственным разрешением, выходящим далеко за пределы дифракции, с использованием обедненного света в форме кольца, чтобы окружить меньший пучок возбуждающего света, чтобы получить суб{2}} нм по оси для разрешение. Этот метод основан на возбуждении флуорофоров синхронизированными лазерными импульсами и пространственно скоординированными круговыми импульсами STED, которые истощают излучаемый свет, подавляя флуоресценцию возбужденных молекул вокруг фокуса лазерного сканирования. Флуоресценция, генерируемая на периферии пятна, подавляется, но не в центре пятна, что значительно уменьшает размер флуоресцентного пятна и, соответственно, значительно увеличивает разрешение. STED оказался полезным инструментом для обнаружения живых клеток с высоким разрешением. Другие новые методы сверхвысокого разрешения, такие как фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM) и микроскопия структурированного освещения (SIM), также станут основными инструментами для визуализации живых клеток в ближайшем будущем.
Все более широкое использование генетически кодируемых флуоресцентных белков и передовых синтетических флуорофоров для визуализации живых клеток открывает двери для новых оптических методов мониторинга временной динамики и пространственных отношений. Теперь у микроскопистов есть полный набор инструментов для наблюдения и записи данных изображений клеточных процессов, происходящих в широком диапазоне временных масштабов и с различными разрешениями. Более медленные события можно легко наблюдать и регистрировать с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, в то время как более быстрые кинетические события можно получить с помощью технологии вращающихся дисков. Кроме того, многофотонная микроскопия позволяет получить глубокое изображение в толстых тканях, а методы полного внутреннего отражения позволяют исследовать поверхности мембран с конфокальной точностью. Усовершенствованные флуоресцентные методы, такие как FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM и STED, могут использоваться для мониторинга белок-белковых взаимодействий с разрешением, зачастую лучшим, чем позволяет дифракционный предел. Благодаря достижениям в технологии флуорофоров, микроскопов и детекторов, «под микроскопом» окажется более широкий мир.
