Визуализация многофотонной микроскопии: разнообразные методы визуализации нейронов in vivo
По сравнению с традиционным однофотонным широкопольным флуоресцентным микроскопом, многофотонная микроскопия (MPM) имеет функции оптического секционирования и глубокого изображения. В 2019 году Джером Лекок и др. обсудили связанную технологию MPM с трех аспектов: визуализация нейронов глубоко в мозгу, визуализация массивных нейронов и высокоскоростная визуализация нейронов.
Чтобы связать активность нейронов со сложным поведением, обычно необходимо визуализировать нейроны в глубокой коре, что требует, чтобы MPM обладал способностью глубокой визуализации. Возбуждающий и испускаемый свет будет сильно рассеиваться и поглощаться биологической тканью, что является основным фактором, ограничивающим глубину визуализации MPM. Хотя проблема рассеяния может быть решена за счет увеличения интенсивности лазера, это повлечет за собой другие проблемы, такие как прожигание образца, расфокусировка и флуоресцентное возбуждение вблизи поверхности. Лучший способ увеличить глубину визуализации MPM — использовать более длинные волны в качестве возбуждающего света.
Кроме того, для двухфотонной (2P) визуализации возбуждение флуоресценции вне фокуса и у поверхности является двумя самыми большими факторами, ограничивающими глубину, в то время как для трехфотонной (3P) визуализации эти две проблемы значительно уменьшаются, но Трехфотонная визуализация за счет флуоресценции Поперечное сечение поглощения группы намного меньше, чем у 2P, поэтому требуется на порядок более высокая энергия импульса для получения той же интенсивности сигнала флуоресценции, что и при возбуждении 2P. Функциональная 3P-микроскопия более требовательна, чем структурная 3P-микроскопия, которая требует более быстрого сканирования для своевременного определения активности нейронов; требуется более высокая энергия импульса, чтобы собрать достаточное количество сигналов в течение времени задержки каждого пикселя.
Сложное поведение часто связано с большими сетями мозга как с локальными, так и с долгосрочными связями. Чтобы связать активность нейронов с поведением, необходимо одновременно отслеживать активность очень крупных и широко распространенных нейронов. Нейронная сеть в мозгу обрабатывает поступающие стимулы в течение десятков миллисекунд. Чтобы понять эту быструю нейронную сеть. Для изучения динамики нейронов требуется, чтобы MPM обладал способностью быстро отображать нейроны. Методы быстрого MPM можно разделить на методы однолучевого сканирования и методы многолучевого сканирования.
Технология однолучевого сканирования обеспечивает высокоскоростное сканирование нервной ткани с большим полем зрения (FOV).
При использовании MPM для визуализации нейронов сканирование с произвольным доступом, то есть лазерный луч быстро сканируется в любой выбранной точке всего поля зрения, может сканировать только интересующие нейроны, что не только позволяет избежать сканирования каких-либо немеченых нервных волокон. также оптимизировать время сканирования лазерного луча. Сканирование с произвольным доступом (рис. 1) может быть достигнуто с помощью акустооптического дефлектора (АОД), который работает, связывая пьезоэлектрический преобразователь с радиочастотным сигналом с подходящим кристаллом. Возникающие в результате акустические волны индуцируют периодическую решетку показателя преломления. Дифракция возникает, когда лазерный луч проходит через решетку. Интенсивность и частоту звуковой волны можно регулировать с помощью радиочастотного электрического сигнала для изменения интенсивности и направления дифрагированного света, так что одномерное горизонтальное произвольное точечное сканирование может быть реализовано с использованием одного AOD, а также может быть реализовано 3D с помощью пары AOD в сочетании с другими технологиями осевого сканирования с произвольным доступом. Однако этот метод очень чувствителен к движению образца и подвержен артефактам движения. В настоящее время широко используется быстрое растровое сканирование, то есть прогрессивное сканирование в FOV, поскольку алгоритм может легко устранять артефакты движения.
Двухфотонная визуализация нейронов L2/3 неокортекса in vivo на основе AOD [2]
Существует много способов реализовать быстрое растровое сканирование, используя вибрирующее зеркало для быстрого 2D-сканирования, комбинируя вибрирующее зеркало и регулируемую электрическую линзу для быстрого 3D-сканирования, но регулируемая электрическая линза не может быстро сфокусироваться в осевом направлении из-за ограничения механическая инерция Переключение, влияющее на скорость визуализации, теперь можно заменить пространственным модулятором света (SLM).
Дистанционная фокусировка также является средством получения трехмерного изображения, как показано на рис. 2. В модуле LSU сканирующий гальванометр сканирует по горизонтали, а модуль ASU включает в себя объектив L1 и зеркало M, а осевое сканирование реализуется путем регулировки положение M. Этот метод может не только исправить оптическую аберрацию, вносимую линзой основного объектива L2, но и обеспечить быстрое осевое сканирование. Чтобы получить больше изображений нейронов, FOV можно увеличить, отрегулировав конструкцию объектива микроскопа, но объектив с большой числовой апертурой и большим FOV обычно тяжелый и не может быстро перемещаться для быстрого осевого сканирования, поэтому системы с большим FOV полагаются на Telefocus. , SLM и регулируемые моторизованные линзы.
Принципиальная схема двухфотонной системы визуализации с дистанционной фокусировкой[3] Технология многолучевого сканирования позволяет одновременно отображать различные положения нейронной ткани.
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 мм друг от друга) места визуализации (рис. 3C, D); для соседних областей он обычно использует несколько лучей одного объектива для визуализации (рис. 3E, F). Метод многолучевого сканирования должен уделять особое внимание проблеме перекрестных помех между лучами возбуждения, которую можно решить с помощью метода пост-светового разделения источников или метода пространственно-временного мультиплексирования. Метод апостериорного разделения источников света относится к использованию алгоритмов для разделения лучей для устранения перекрестных помех; метод пространственно-временного мультиплексирования относится к одновременному использованию нескольких лучей возбуждения, импульсы каждого луча задерживаются во времени, так что отдельные лучи, возбуждаемые разными лучами, могут быть временно разделены. флуоресцентный сигнал. Можно визуализировать больше нейронов, вводя больше лучей, но несколько лучей увеличат перекрытие времени затухания флуоресценции, что ограничивает способность различать источники сигнала; а мультиплексирование отрицательно влияет на скорость работы электронных устройств. Высокие требования; большое количество лучей также требует более высокой мощности лазера для поддержания приблизительного отношения сигнал/шум одного луча, что может легко привести к повреждению тканей.
Технология визуализации больших площадей
В последние годы развитие различных технологий MPM расширило область нашей визуализации нервной ткани, позволив нам визуализировать больше нейронов глубоко в мозгу с более высокой скоростью, что значительно способствовало исследованиям в области неврологии и позволило нам получить более четкое понимание. работы мозга.
