Технология многофотонной микроскопии: поляризационная-разрешенная микроскопия второй-генерации гармоник и ее обработка изображений
В нелинейных оптических микроскопах для наблюдения эндогенных волокнистых структур обычно используется визуализация с генерацией второй гармоники (ГВГ), а интенсивность ГВГ во многом зависит от относительного угла между направлением поляризации падающего луча и осью ориентации молекулы-мишени. Таким образом, визуализация ГВГ на основе поляризации (P-SHG) может получить структурную информацию о молекулах-мишенях путем анализа функциональной взаимосвязи между интенсивностью сигнала ГВГ и состоянием поляризации падающего луча. Сейчас он используется как важный инструмент для медицинского и биологического анализа.
Простые изображения ГВГ можно получить с помощью традиционной флуоресцентной микроскопии с двух-фотонным возбуждением (TPM). Большинство систем TPM по-прежнему используют метод сканирования одним лучом, основанный на движущемся зеркале, временное разрешение которого зависит от физической скорости движения зеркала. Чтобы добиться более быстрого получения изображения, система TPM также может использовать метод многолучевого сканирования (рис. 1А), один из которых заключается в использовании сканирующего устройства с вращающимся диском. Это устройство состоит из коаксиального проигрывателя с микролинзами и проигрывателя с точечными отверстиями, при этом микролинзы и отверстия на каждом поворотном столе соответствуют друг другу-к-одному.
Когда лазер проходит через поворотный стол с микролинзами, волновой фронт охватывает несколько микролинз. Различные микролинзы фокусируют разные части волнового фронта в разных положениях и проходят через соответствующие отверстия, образуя множество микролучей. Эти микролучи, попадающие на образец, могут одновременно возбуждать несколько сигналов. Эти сигналы возвращаются по системе микроскопа, снова проходят через точечное отверстие и, наконец, отражаются дихроичным зеркалом между двумя поворотными столами в устройство обнаружения. Однако обычно используемый титан-сапфировый лазер с-синхронизацией мод в качестве источника света имеет недостаточную энергию, что ограничивает количество лучей возбуждения и приводит к небольшому эффективному полю зрения (FOV) для TPM (TPM-SD) с использованием вращающегося блока сканирования.
Ай Гото и др. целью которого было получение высокоскоростной-скоростной визуализации P-SHG с большим полем зрения (FOV) с использованием системы TPM-SD. Поэтому в систему TPM-SD был введен лазерный источник на основе Yb с более высокой пиковой мощностью.
Это схематическая диаграмма разработанной ими системы TPM-SD. Источником света системы является лазер на основе Yb, генерирующий фемтосекундные импульсы с центральной длиной волны 1042 нм, средней мощностью 4 Вт, длительностью импульса 300 фс и частотой следования 10 МГц. Система сначала регулирует мощность лазера с помощью полуволновой пластины и поляризатора лазера Глана, а затем расширяет луч с помощью расширителя луча. Расширенный луч вводится в блок сканирования поворотного стола, и несколько микролучей, выходящих из блока сканирования, фокусируются на нескольких точках образца через линзу водоиммерсионного объектива. Чтобы отрегулировать состояние поляризации светового луча в объективе, на оптическом пути луча возбуждения размещают полуволновую и четвертьволновую пластины.
