Подготовка и наблюдение биологических образцов для электронной микроскопии
Разрешение микроскопа зависит от длины волны используемого света. Электронный микроскоп, который начал появляться в 1933 году, использует в качестве источника света электронный луч с длиной волны, намного меньшей, чем длина волны видимого света, поэтому разрешающая способность, которую он может достичь, значительно улучшена по сравнению с разрешением оптического микроскопа. Разница в источниках света определяет и ряд различий между электронными и оптическими микроскопами.
В соответствии с различиями в принципах получения изображений электронным лучом и разными способами воздействия на образцы современные электронные микроскопы разделились на множество типов. В настоящее время наиболее распространенными являются трансмиссионные электронные микроскопы и сканирующие электронные микроскопы. Общее увеличение первого может составлять от 1000-1000000. Суммарное увеличение последнего может варьироваться от 20 до 300,000 раз. Этот эксперимент в основном представляет собой подготовку двух типов образцов микроскопа: просвечивающего электронного микроскопа и сканирующего электронного микроскопа.
2. Оборудование
1. Бактерия кишечная палочка (Escherichia coli) скошенная.
2. Раствор или реагент амилацетат, концентрированная серная кислота, абсолютный этанол, стерильная вода, 2%-ный фосфорновольфрамат натрия (рН 6.5-8.0), водный раствор, 0.3% полиэтилен. раствор формальдегида (растворим в хлороформе), клетки. Пигмент С, ацетат аммония, плазмида pBR322.
3. Инструменты или другие принадлежности: обычный оптический микроскоп, медная сетка, фарфоровая воронка, стакан, чашка, стерильная пипетка, стерильный пинцет, булавки, предметные стекла, счетная доска, вакуумная машина для нанесения покрытия, сушилка критической точки и т. д.
3. Этапы работы
(1) Подготовка проб и наблюдение для просвечивающей электронной микроскопии.
1. Обработка металлической сетки
Образец для оптической микроскопии помещают на предметное стекло для наблюдения. Однако в просвечивающей электронной микроскопии, поскольку электроны не могут проникнуть через лист стекла, сетчатые материалы можно использовать только в качестве носителей, обычно называемых несущими сетками. Несущую сетку можно разделить на множество различных спецификаций в зависимости от разных материалов и форм, среди которых наиболее часто используемой является медная сетка 200-400 (количество отверстий). Перед использованием медную сетку необходимо обработать, чтобы удалить грязь и сохранить ее в чистоте, в противном случае это повлияет на качество поддерживающей пленки и четкость фотографий образцов. В этом эксперименте используется медная сетка 400-, с которой можно обращаться следующим образом: сначала замочить и отбелить ее амилацетатом в течение нескольких часов, затем несколько раз промыть дистиллированной водой, а затем замочить в абсолютном этаноле на несколько часов. обезвоживание. Если медная сетка после вышеуказанных методов все еще не чистая, ее можно замочить в разбавленной концентрированной серной кислоте (1:1) на 1–2 минуты или прокипятить в 1% растворе NaOH в течение нескольких минут, затем промыть дистиллированной водой. воды несколько раз, а затем поместите в безводный обезвоженный раствор этанола и отложите в сторону.
2. Подготовка опорной мембраны
При наблюдении образцов сетка-носитель также должна быть покрыта слоем неструктурированной однородной пленки, иначе мелкие образцы будут вытекать из отверстий сетки-носителя. Эту пленку обычно называют пленкой-поддержкой или пленкой-носителем. Поддерживающая пленка должна быть электронно-прозрачной, а ее толщина обычно должна быть менее 20 нм; под воздействием электронного луча пленка также должна обладать определенной механической прочностью для сохранения структурной устойчивости и обладать хорошей теплопроводностью; кроме того, в электронной микроскопии следует использовать опорную сетку. Под ней не должно быть видимых структур, химических реакций с переносимым образцом и помех для наблюдения за образцом. Его толщина обычно составляет около 15 нм. Поддерживающая пленка может представлять собой пластиковую пленку (например, коллодионную пленку, полиэтиленформальдегидную пленку и т. д.), углеродную пленку или металлическую пленку (например, бериллиевую пленку и т. д.). В нормальных условиях работы полиэтиленовая пленка может соответствовать этим требованиям. Среди пластиковых пленок коллодионную пленку относительно легко приготовить, но ее прочность уступает полиэтиленформальдегидной пленке.
