Принцип и конструкция флуоресцентного микроскопа
В флуоресцентном микроскопе используется точечный источник света с высокой светоотдачей, который излучает свет определенной длины волны (например, ультрафиолетовый свет длиной 3650 дюймов или фиолетовый синий свет длиной 4200 дюймов) через систему цветовой фильтрации в качестве возбуждающего света и возбуждает флуоресцентные вещества в образце, чтобы излучают различные цвета флуоресценции. После этого его наблюдают посредством увеличения объектива и окуляра. Таким образом, даже при слабой флуоресценции он легко распознается и обладает высокой чувствительностью на сильном контрастном фоне, в основном используется для изучения структуры и функции клеток, а также химического состава. Базовая конструкция флуоресцентного микроскопа состоит из обычного оптического микроскопа и некоторых аксессуаров (таких как источник флуоресцентного света, фильтр возбуждения, разделитель бихроматического луча, блокирующий фильтр и т. д.). Люминесцентные источники света – обычно используют ртутные лампы сверхвысокого давления (50-200Вт), которые могут излучать свет различной длины волны. Однако каждое флуоресцентное вещество имеет длину волны возбуждающего света, которая вызывает самую сильную флуоресценцию, поэтому необходимо добавлять фильтры возбуждения (обычно ультрафиолетовые, фиолетовые, синие и зеленые фильтры возбуждения), чтобы пропускать и освещать только определенную длину волны возбуждающего света. образец, поглощая при этом весь остальной свет. После облучения возбужденным светом каждое вещество излучает видимую флуоресценцию с большей длиной волны, чем облучение, за очень короткий период времени. Флуоресценция имеет специфичность и обычно слабее, чем возбуждающий свет. Чтобы наблюдать специфическую флуоресценцию, за объективом необходимо добавить блокирующий (или подавляющий) фильтр. Он выполняет две функции: во-первых, он поглощает и блокирует попадание возбуждающего света в окуляр, чтобы избежать нарушения флуоресценции и повреждения глаз; во-вторых, он выбирает и пропускает определенную флуоресценцию, отображая определенный цвет флуоресценции. Оба типа фильтров необходимо выбирать для совместного использования.
Существует два типа флуоресцентных микроскопов в зависимости от их оптического пути:
1. Просвечивающий флуоресцентный микроскоп: источник возбуждающего света проходит через материал образца через конденсатор для возбуждения флуоресценции. Обычно используемые коллекторы темнопольного света или обычные светоколлекторы можно использовать для регулировки отражателя для преобразования возбуждающего света и бокового света на образец. Это относительно старомодный флуоресцентный микроскоп. Его преимуществом является то, что флуоресценция сильна при малом увеличении, а недостатком — то, что флуоресценция ослабевает с увеличением увеличения. Следовательно, лучше исследовать материалы более крупных образцов.
2. Флуоресцентный микроскоп с падающим лучом. Это новый тип флуоресцентного микроскопа, разработанный в наше время. В отличие от предыдущего, свет возбуждения падает с объектива на поверхность образца, используя тот же объектив, что и конденсор освещения, и объектив для сбора флуоресценции. К оптическому пути необходимо добавить двухцветный сепаратор пучка, который находится под углом 45 градусов к легкому урану. Возбуждающий свет отражается в линзу объектива и концентрируется на образце. Флуоресценция, генерируемая образцом, а также возбуждающий свет, отраженный от поверхности линзы объектива и покровного стекла, одновременно входят в линзу объектива и возвращаются в сепаратор дихроичного луча, разделяя возбуждение и флуоресценцию. Остаточное возбуждение затем поглощается блокирующим фильтром. Если используются различные комбинации фильтров возбуждения/сепараторов двухцветных лучей/блокирующих фильтров, они могут удовлетворить потребности различных продуктов флуоресцентной реакции. Преимущество этого флуоресцентного микроскопа заключается в том, что поле зрения освещено равномерно, изображение четкое, и чем больше увеличение, тем сильнее флуоресценция.
