Принципы конфокальной микроскопии
Конфокальный микроскоп — это высокоточный инструмент для получения изображений, который появился и был разработан в 1980-х годах и является важным инструментом научных исследований для изучения субмикронных структур. С развитием компьютеров, программного обеспечения для обработки изображений и лазеров конфокальные микроскопы также претерпели большое развитие и в настоящее время широко используются в области биологии, микросистем и измерения материалов. Конфокальный микроскоп — это новый тип микроскопа, объединяющий конфокальный принцип, технологию сканирования и технологию обработки компьютерной графики. Его основными преимуществами являются: высокое боковое разрешение и высокое осевое разрешение, а также эффективное подавление рассеянного света с высокой контрастностью.
Типичная установка конфокального микроскопа заключается в размещении двух небольших отверстий на сопряженной плоскости фокальной плоскости измеряемого объекта, одно из которых расположено перед источником света, а другое — перед детектором, как показано на рисунке. 1. Из рисунка видно, что, когда измеряемый образец находится в плоскости квазифокуса, интенсивность света, собираемая детектирующим концом, является наибольшей; когда измеряемый образец находится вне фокуса, световое пятно на конце обнаружения рассеивается, и интенсивность света быстро уменьшается. Следовательно, через выходное отверстие может пройти только свет, излучаемый точками в фокальной плоскости, тогда как свет, излучаемый точками вне фокальной плоскости, расфокусируется на плоскости выходного отверстия, и большинство из них не может пройти через центральное отверстие. Таким образом, целевая точка наблюдения в фокальной плоскости выглядит яркой, а ненаблюдаемая точка кажется черной в качестве фона, что повышает контрастность и очищает изображение. В процессе визуализации два отверстия конфокальны, конфокальная точка является обнаруженной точкой, а плоскость, в которой расположена обнаруженная точка, является конфокальной плоскостью.
Размер отверстия на детекторе в конфокальной микроскопии играет решающую роль. Это напрямую влияет на разрешение и отношение сигнал/шум системы. Если отверстие слишком велико, эффект конфокального обнаружения не будет достигнут, что не только снижает разрешение системы, но и приводит к большему количеству рассеянного света; если отверстие слишком маленькое, это снизит эффективность обнаружения и уменьшит микроскопическое изображение. яркость. Исследования показали, что при равенстве диаметра пинхола диаметру диска Эйри требования конфокальности выполняются, а эффективность обнаружения существенно не снижается. Поскольку диаметр точечного отверстия, как правило, составляет порядка микрона, если есть отклонение между точкой фокусировки лазерного луча и положением точечного отверстия, произойдет искажение сигнала. Поэтому конфокальные микроскопы обычно используют систему автофокусировки, что практически увеличивает время измерения.
Поскольку лазерный конфокальный сканирующий микроскоп является точечным, то для получения двухмерного изображения объекта необходимо использовать двумерное сканирование в направлениях x и y. В разных микроскопах используются разные методы сканирования:
(1) Сканирование объекта. То есть сам объект движется по определенному закону, а световой пучок остается неизменным. Преимущества: стабильный оптический тракт; Недостатки: требуется большой стол сканирования, поэтому скорость сканирования сильно ограничена.
(2) Система сканирования луча формируется с использованием отражательного гальванометра. То есть, управляя сканирующим гальванометром, сфокусированное световое пятно регулярно отражается на определенный слой объекта для завершения двумерного сканирования. Его преимущество в том, что он обладает высокой точностью и часто используется для высокоточных измерений. Скорость сканирования улучшилась по сравнению со сканированием объектов, но все еще не так быстро.
(3) Используйте акустооптический отклоняющий элемент для сканирования, и сканирование осуществляется путем изменения выходной частоты звуковой волны, а затем изменения направления передачи световой волны. Его выдающимся преимуществом является то, что скорость сканирования очень высока. Система сканирования, разработанная в США, использует акустооптический дефлектор для создания видеоизображений в реальном времени. Для сканирования двумерного изображения требуется всего 1/30 с, и он обеспечивает вывод практически в реальном времени.
(4) сканирование диска Нипкова. Процесс сканирования завершается вращением диска Нипкова, в то время как другие компоненты остаются неподвижными. Его можно отобразить за один раз, и скорость очень высока. Однако, поскольку луч изображения представляет собой внеосевой свет, внеосевая аберрация объектива должна быть скорректирована, а коэффициент использования световой энергии очень низок.
