Принципы лазерной конфокальной микроскопии (LSCM)
В лазерном конфокальном микроскопе используется точечное освещение, расположенное позади источника света, и точечное отверстие для обнаружения, расположенное перед детектором, для обеспечения точечного освещения и обнаружения точек. Свет от источника света фокусируется на точке в фокальной плоскости образца с помощью света, излучаемого через точечное отверстие освещения, и флуоресценция, излучаемая из этой точки, отображается внутри точечного отверстия обнаружения, а любой излучаемый свет за пределами этой точки блокируется обнаружение точечного отверстия. Осветительное отверстие и точечное отверстие обнаружения являются сопряженными для освещенной или обнаруженной точки, так что обнаруженная точка является конфокальной точкой, а плоскость, в которой расположена обнаруженная точка, является конфокальной плоскостью. Компьютер отображает обнаруженную точку на экране компьютера в виде точки изображения. Чтобы создать полное изображение, система сканирования на оптическом пути сканирует фокальную плоскость образца, создавая таким образом полное конфокальное изображение. Пока предметный столик перемещается вверх и вниз вдоль оси Z, новый уровень образца перемещается в конфокальную плоскость, и новый уровень образца отображается на мониторе, поскольку ось Z продолжает перемещаться. при движении получаются последовательные просветленные изображения разных уровней образца.
В традиционном оптическом микроскопе используется полевой источник света, на изображение каждой точки образца будет влиять дифракция или рассеяние света от соседних точек; лазерный сканирующий конфокальный микроскоп использует лазерный луч, проходящий через освещенное точечное отверстие, для формирования точечного источника света на образце, сканируемом в каждой точке внутренней фокальной плоскости, образец в облучаемой точке, визуализация точечного отверстия, путем обнаружения точечного отверстия после точки светоумножительной трубки (ФЭУ) или устройства с холодной электросвязью (cCCD). Получаемое поточечно или построчно, на экране монитора компьютера быстро формируется флуоресцентное изображение. Отверстие для освещения и отверстие для обнаружения относительно фокальной плоскости объектива сопряжены, точка на фокальной плоскости одновременно фокусируется на точечном отверстии для освещения и точечном отверстии для излучения, точка вне фокальной плоскости не будет при обнаружении точечное отверстие при визуализации, так что полученное конфокальное изображение представляет собой оптическое сечение образца, преодолевая недостатки обычного нечеткого изображения микроскопа.
По своему основному принципу лазерный конфокальный микроскоп представляет собой современный оптический микроскоп, это обычный световой микроскоп, в котором используются следующие усовершенствования.
1. Используйте лазер в качестве источника света, поскольку монохроматичность лазера очень хорошая, длина волны источника света одинакова, что принципиально исключает хроматическую аберрацию.
2. Использование конфокальной технологии в фокальной плоскости объектива, расположенного посередине с небольшим отверстием в перегородке, фокальная плоскость вне блокировки рассеянного света, устраняя сферическую аберрацию; и дополнительно устранить хроматическую аберрацию.
3. Лазерный конфокальный микроскоп, использующий технологию точечного сканирования для разложения образца в двухмерное или трехмерное пространство на бесчисленное количество точек, с помощью очень маленького лазерного луча (точечного источника света) поточечно, построчно сканируя изображение, а затем через микрокомпьютерная комбинация целой плоскости или трехмерного изображения. Традиционный световой микроскоп представляет собой полевой источник света при однократной визуализации, при этом образцы в каждой точке изображения будут соседствовать с точкой дифрагированного света и интерференции рассеянного света. Четкость и точность этих двух изображений невозможно сравнивать.
4. Сбор и обработка оптических сигналов с помощью компьютера и усиление сигналов с помощью фотоумножителя.
В лазерном конфокальном микроскопе компьютер заменяет человеческий глаз или камеру для наблюдения и видеозаписи, а полученные изображения оцифровываются и могут быть обработаны на компьютере для повторного улучшения четкости изображений. Более того, использование фотоумножителей позволяет усиливать очень слабые сигналы, значительно повышая чувствительность. В результате совместного использования вышеперечисленных технологий можно сказать, что LSCM является самым совершенным микроскопом в мире. Можно сказать, что LSCM представляет собой сочетание технологии производства микроскопов, фотоэлектрических технологий и компьютерных технологий**, является неизбежным продуктом развития современных технологий.
