Технические характеристики и навыки использования двухфотонного флуоресцентного микроскопа
Двухфотонная флуоресцентная микроскопия — это новая технология, сочетающая в себе лазерную сканирующую конфокальную микроскопию и технологию двухфотонного возбуждения.
Основной принцип двухфотонного возбуждения заключается в следующем: в случае высокой плотности фотонов флуоресцентные молекулы могут одновременно поглощать два длинноволновых фотона и излучать более коротковолновый фотон после короткого периода так называемого времени жизни в возбужденном состоянии. . ; Эффект такой же, как при использовании фотона с длиной волны, равной половине длинной волны, для возбуждения флуоресцентной молекулы. Двухфотонное возбуждение требует высокой плотности фотонов. Чтобы не повредить клетки, в двухфотонной микроскопии используются высокоэнергетические импульсные лазеры с синхронизацией мод. Лазер, излучаемый этим лазером, имеет высокую пиковую энергию и низкую среднюю энергию, ширина его импульса составляет всего 100 фемтосекунд, а его период может достигать 80-100 мегагерц. При использовании объектива с высокой числовой апертурой для фокусировки фотонов импульсного лазера плотность фотонов в фокальной точке объектива самая высокая, и двухфотонное возбуждение происходит только в фокальной точке объектива, поэтому двухфотонный микроскоп не требует конфокального отверстия, что повышает эффективность обнаружения флуоресценции. Это важный метод исследования в области морфологии, молекулярной клеточной биологии, неврологии и фармакологии.
1. Предпосылки появления двухфотонной микроскопии - два ограничения традиционной лазерной конфокальной микроскопии:
1) Одним из них является явление фототоксичности: поскольку конфокальное отверстие должно быть достаточно маленьким для получения изображения с высоким разрешением, а маленькая апертура будет блокировать большую часть флуоресценции, испускаемой образцом, включая флуоресценцию, испускаемую из фокальной плоскости, соответствующее Да, свет возбуждения должен быть достаточно сильным, чтобы получить достаточное отношение сигнал/шум; и высокоинтенсивный лазер вызовет быстрое исчезновение флуоресцентного красителя во время непрерывного сканирования, и флуоресцентный сигнал будет становиться все слабее и слабее по мере сканирования.
2) Еще одна проблема – фототоксичность. При лазерном облучении многие молекулы флуоресцентных красителей будут продуцировать цитотоксины, такие как синглетный кислород или свободные радикалы, поэтому время сканирования и плотность оптической мощности возбуждающего света должны быть ограничены в эксперименте для поддержания плотности образца. активный. При исследовании активных образцов, особенно различных стадий роста и развития активных образцов, фотообесцвечивание и фототоксичность делают эти исследования очень ограниченными.
2. Почему вы говорите, что двухфотонные микроскопы вообще не нужно оснащать лазерами ультрафиолетового возбуждения?
Двухфотонная микроскопия — технология возбуждения флуоресценции, основанная на эффекте двухфотонного возбуждения: молекулы флуоресцентного красителя можно возбудить, поглотив одновременно два низкоэнергетических фотона (интервал времени между двумя фотонами, достигающими флуоресцентных молекул, составляет менее 1 фемтосекунды). ), его эффект возбуждения может быть эквивалентен поглощению высокоэнергетического фотона с длиной волны 1/2. Например, поглощение двух фотонов с красной длиной волны эквивалентно поглощению молекулой ультрафиолета. Длинноволновые фотоны не так легко поглощаются клетками, поэтому фототоксичность для живых клеток снижается, а также снижается фотообесцвечивание. Таким образом, он не только выполняет функцию ультрафиолетового возбуждения, но и предотвращает повреждение образца ультрафиолетовым светом.
3. Что особенного в лазере двухфотонного микроскопа?
Вероятность двухфотонного поглощения зависит от того, насколько точно два падающих фотона совпадают в пространстве и времени (два фотона должны прибыть в течение 10-18 секунд). Сечение двухфотонного поглощения мало, и возбуждаются только флуорофоры в областях с большим потоком фотонов. Поэтому большинство используемых лазеров представляют собой титан-сапфировые лазеры, которые могут достигать пикосекундной или фемтосекундной скорости сканирования и имеют очень высокую пиковую мощность и низкую среднюю мощность, так что фотообесцвечивание и фототоксичность могут быть уменьшены или устранены. Самое главное — обеспечить очень высокую плотность фотонов в малом диапазоне, что может обеспечить одновременное возбуждение двух фотонов.
4. В чем преимущества двухфотонного возбуждения?
1) Повышение селективности красителя: диапазон возбуждающего света лазера конфокальной системы (Ar, Ar/Kr, HeNe) составляет 488 нм - 647 нм. Это означает эксперименты с УФ-возбуждаемыми флуоресцентными красителями, например, с DAPI, Hoescht. Длина волны двухфотонного возбуждения вдвое больше, чем у однофотонного, поэтому красители, возбуждаемые ультрафиолетом, могут возбуждаться ближним инфракрасным светом.
2) Уменьшение фотообесцвечивания: из-за снижения фотообесцвечивания повышается вероятность успеха экспериментов с использованием CFP/YFP для резонансной передачи энергии флуоресценции (FRET).
3) Не требуется специальный объектив: с аппаратной точки зрения возбуждение УФ-возбуждаемых красителей с длиной волны ближнего инфракрасного света не требует специальных УФ-оптических компонентов.
4) Улучшить отношение сигнал-шум: длина волны возбуждающего света и длина волны излучаемого света имеют большую разницу, что улучшает отношение сигнал-шум.
5) Обесцвечивание, локализованное в фокальной точке: поскольку возбуждение флуоресценции происходит только в фокальной точке объектива, нет необходимости в конфокальном точечном отверстии. Это улучшает обнаружение света, а фотообесцвечивание происходит только в фокусе.
6) Легче проникать в образцы: инфракрасный свет не рассеивается клетками и может проникать в более глубокие образцы.
5. По сравнению с лазерной сканирующей конфокальной микроскопией, что является самым большим преимуществом двухфотонной микроскопии?
1) Снижение фотообесцвечивания.
2) Снижение фототоксичности.
3) Его нелегко разбросать, и легче проникнуть в толстые образцы, такие как срезы мозга.
