Разница между положительным и отрицательным фазовым контрастом в микроскопе
В зависимости от конфигурации и характера фазового кольца, расположенного в задней фокальной плоскости объектива, образцы можно наблюдать с положительным или отрицательным фазовым контрастом. В этом интерактивном учебном пособии изучается взаимосвязь между объемным (S), дифракционным (D) и результирующими яркими частицами (P-волны), а также положительной и отрицательной фазово-контрастной микроскопией. Кроме того, также представлены геометрия фазовой пластины и репрезентативные изображения образцов.
Когда люди используют это в своей работе сейчас, большинство исследователей находятся в отрицательной разнице, а сейчас положительная разница не играет большой роли в текущей научно-исследовательской работе.
В учебном пособии фазовое изображение инициализируется случайно выбранным образцом, который появляется в окне фазово-контрастного изображения, а соответствующее волновое соотношение отображается в левом соседнем окне изображения. Чтобы работать с учебным пособием, используйте курсор мыши, чтобы перемещать перевод между положительным и отрицательным фазовым контрастом или ползунок режима фазового контраста яркого освещения. При перемещении ползунка изображения, появляющиеся в окне фазово-контрастного изображения, изменяют внешний вид образца в текущем режиме визуализации, заданном ползунком. Кроме того, под графиком сигнала находится фазовая пластина, форма которой меняется в соответствии с режимом отображения, выбранным ползунком. Чтобы просмотреть новый образец, используйте раскрывающееся меню Selected Sample, чтобы выбрать другой образец.
График конфигурации фазовой пластины, волновых соотношений и векторов, связанных с созданием положительных и отрицательных фазово-контрастных изображений, представлен на рисунке 1. Также показаны примеры образцов, полученных с помощью этих методов. В оптической конфигурации с положительным фазовым контрастом (верхний ряд изображения на рисунке 1) объемный (S)-волновой фронт проходит через фазовую пластину, что приводит к чистому сдвигу фазы на 180 градусов вперед по фазе на 1/4 длины волны ( 1 половина длины волны). Усовершенствованные объемные волновые фронты теперь могут участвовать в деструктивной интерференции с дифрагированными (D) волнами в плоскости промежуточного изображения. В большинстве случаев простого сдвига относительной фазы окружающего волнового фронта недостаточно для создания высококонтрастных изображений в микроскопах Nikon. Это связано с тем, что амплитуда окружающих волн значительно больше, чем у дифрагированных волн, и подавляет результирующее изображение, созданное интерференцией части общего числа волн. Для уменьшения окружающего волнового фронта до значения, более близкого к амплитуде дифрагированных волн (и выполнения интерференции в плоскости изображения), непрозрачность в фазовом кольце объектива достигается нанесением полупрозрачного металла (нейтрального возрастающего по плотности ) покрытие Пол. Окружающие световые волны, которые почти полностью проходят через фазовое кольцо по конструкции, под фазово-контрастной микроскопией значительно уменьшаются по амплитуде за счет непрозрачности фазовой пластины до значения в диапазоне от 10 до 30 процентов от исходной интенсивности.
Поскольку результирующая волна частиц создается интерференцией* окружающего и дифрагированного волновых фронтов, амплитуда волны частицы (P), создаваемой интерференцией волновых фронтов, прибывающих в плоскость изображения, теперь намного меньше, чем амплитуда окружающей волны в сексуальном режиме. нанесено плотное покрытие. Чистый эффект заключается в преобразовании относительной разности фаз, вызванной прохождением света, выходящего из плоскости изображения, через образец, в разность амплитуд (интенсивности). Поскольку человеческий глаз интерпретирует разницу в интенсивности как контраст, образец теперь виден в окуляр микроскопа, и его также можно зафиксировать на мембране с помощью обычных систем камер или в цифровом виде с помощью устройств CCD или CMOS. Все системы положительного фазового контраста избирательно продвигают фазу фронта линейной объемной (S) волны относительно сферического дифрагированного (D) волнового фронта. Образцы с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, кажутся темнее на нейтральном сером фоне, в то время как образцы с более низким показателем преломления, чем у плавающей среды, кажутся ярче, чем на сером фоне.
Чтобы изменить пространственное разделение дифрагированных волновых фронтов, окружающих фазу и амплитуду в фазово-контрастной оптической системе, был введен ряд конфигураций фазовых пластин. Поскольку фазовая пластина расположена в задней фокальной плоскости объектива (плоскости дифракции) или очень близко к ней, весь свет, проходящий через микроскоп, должен проходить через этот компонент. Часть фазовой пластины в ее кольцевом фокусе конденсатора называется сопряженной областью, а оставшаяся часть — дополнительной областью. Сопряженная область содержит материал, ответственный за изменение фазы окружающего (недифрагированного) света на плюс или минус 90 градусов по отношению к дифрагированному волновому фронту. Как правило, площадь кольца с фазовым сопряжением шире (около 25 процентов), чем площадь, определяемая изображением конденсирующего кольца, чтобы уменьшить количество окружающего света, который распространяется на дополнительную область.
Большинство фазовых пластин, выпускаемых современными производителями микроскопов, изготавливаются путем вакуумного напыления тонких диэлектрических и металлических пленок на стеклянную пластину или устанавливаются непосредственно на поверхность линзы объектива микроскопа. Роль диэлектрической пленки заключается в фазировании света, в то время как металлическая пленка ослабляет интенсивность нерассеянного света. Некоторые производители используют несколько антибликовых покрытий в сочетании с пленкой, чтобы уменьшить количество бликов и отражение рассеянного света обратно в оптическую систему. Если фазовая пластинка не сформирована на поверхности линзы, ее обычно вклеивают между последовательными линзами, расположенными в фокальной плоскости вблизи задней части объектива. Толщина и показатель преломления диэлектрического, металлического и просветляющего покрытий, а также оптического цемента тщательно выбираются для получения желаемого фазового сдвига между комплементарными и сопряженными областями фазовой пластины. С точки зрения оптики, фазовая пластина, которая изменяет фазу относительно окружающего света для дифракции света на 90 градусов (положительно или отрицательно), называется четвертьволновой пластиной из-за влияния на нее оптической разности хода.
Общий вид инверсии положительной фазы показан на рисунке 1. Пластина с положительным фазовым контрастом (левая часть рисунка 1) продвигает объемную волну на 1/4 длины волны из-за эрозионного кольца в стеклянной пластине, которое может быть уменьшено верхним проходом в пластине с высоким индексом. Пройденный физический путь волны. Из-за взаимодействия с образцом, когда дифрагированные лучи образца (D) задерживаются, разность оптических путей между огибающей и дифрагированной волнами, исходящими из фазовой пластины, составляет половину длины волны на 1/4 длины волны. Конечным результатом является разность оптических путей в 180- градусов между окружающими и дифрагированными волнами, что приводит к деструктивной интерференции для образцов с высоким показателем преломления между плоскостями изображения. Амплитудная кривая положительной фазы противоположной деструктивной интерференционной волны показана на верхнем графике рис. более темный фон. Внизу изображение зеленых водорослей Zygnema, показанное справа (обозначено DL). Между рисунком и изображением на Рисунке 1 появляется вектор, представленный изменением длины волны на 1/4, который показан как объемная волна на 90- градусов, вращающаяся против часовой стрелки в положительном фазовом контрасте.
В качестве альтернативы, оптика микроскопа также может быть изготовлена так, чтобы создавать отрицательную фазу в противоположном направлении, как показано в нижней части рисунка 1, и в этом случае объемные (S)-волны задерживаются (а не опережают) на четверть длины волны относительно одна дифрагированная (D) волна. В результате образцы с высокими показателями преломления кажутся ярче на более темном сером фоне (см. нижнее изображение, обозначенное BM на рис. 1). В противоположной отрицательной фазе фазовая пластина объектива содержит приподнятое кольцо, которое задерживает фазу (а не продвигает фазу как положительную фазу, противоположную), проходя четверть длины волны относительно фазы дифрагированной волны в качестве объемной волны нулевого порядка. Поскольку дифрагированные волны задерживаются на четверть длины волны при прохождении через образец, разность оптических путей между окружающими и дифрагированными волнами устраняется, и образец с высоким показателем преломления создает конструктивную интерференцию в плоскости изображения. Обратите внимание, что результирующая волна частицы (P) имеет более высокую амплитуду, чем волна объемного звука (S) в отрицательном фазовом контрасте. Также показан отрицательный реверс фазы, когда волновой вектор кругосветного плавания проходит через поворот векторной диаграммы на 90 градусов по часовой стрелке.
