Основным методом наблюдения оптического микроскопа является наблюдение флуоресценции.
Флуоресценция относится к процессу, при котором флуоресцентное вещество излучает свет с большей длиной волны почти одновременно, когда оно облучается светом с определенной длиной волны (рис. 1). Когда свет определенной длины волны (длина волны возбуждения) попадает на молекулу, например, в флуорофоре, энергия фотона поглощается электронами молекулы. Затем электроны переходят из основного состояния (S0) в более высокий энергетический уровень, возбужденное состояние (S1'). Этот процесс называется возбуждением ①. Электрон остается в возбужденном состоянии в течение 10-9–10-8 секунд, в течение которых электрон теряет часть энергии②. В процессе выхода электронов из возбужденного состояния (S1) и возврата в основное состояние ③ высвобождается оставшаяся энергия, поглощенная в процессе возбуждения.
Время пребывания флуоресцентной молекулы в возбужденном состоянии представляет собой время жизни флуоресценции, которое обычно находится на уровне наносекунд и является неотъемлемой характеристикой самой флуоресцентной молекулы. Визуализация времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой используется технология визуализации времени жизни флуоресценции, называется визуализацией времени жизни флуоресценции (FLIM). В дополнение к визуализации интенсивности флуоресценции можно получить более глубокие функциональные и точные измерения для получения молекулярной конформации, межмолекулярных взаимодействий и микроокружения молекул. Информация, которую трудно получить с помощью обычного оптического изображения.
Еще одним важным свойством флуоресценции является стоксов сдвиг, разница в длине волны между пиками возбуждения и излучения (рис. 2). Обычно длина волны излучения больше, чем длина волны возбуждения. Это связано с тем, что электроны будут терять часть своей энергии в процессе релаксации после возбуждения флуоресцентного вещества и до испускания фотонов. Флуоресцентные вещества с большими стоксовыми сдвигами легче наблюдать под флуоресцентным микроскопом.
Флуоресцентная микроскопия и кубы флуоресцентных фильтров
Флуоресцентный микроскоп — это оптический микроскоп, который использует свойства флуоресценции для наблюдения и визуализации и широко используется в различных областях, таких как клеточная биология, нейробиология, ботаника, микробиология, патология и генетика. Флуоресцентная визуализация обладает преимуществами высокой чувствительности и высокой специфичности и очень подходит для наблюдения за распределением специфических белков и органелл в тканях и клетках, изучения колокализации и взаимодействия, отслеживания жизненных динамических процессов, таких как изменения концентрации ионов. , и т. д.
Большинство молекул в клетках не флуоресцируют, и чтобы их увидеть, их нужно пометить флуоресцентно. Существует множество методов флуоресцентной маркировки, например, прямая маркировка (например, с использованием DAPI для маркировки ДНК) или иммунное окрашивание с использованием антигенсвязывающих свойств антител или использование флуоресцентных белков (таких как GFP, зеленый флуоресцентный белок) для мечения белков-мишеней. и обратимое связывание. Синтетические красители (такие как Fura-2) и так далее.
В настоящее время флуоресцентный микроскоп стал стандартным оборудованием для визуализации в различных лабораториях и платформах визуализации и является хорошим помощником в наших повседневных экспериментах. Флуоресцентные микроскопы в основном делятся на три категории: прямые флуоресцентные микроскопы (подходят для срезов), инвертированные флуоресцентные микроскопы (подходят для живых клеток с учетом срезов), флуоресцентные стереоскопы (подходят для более крупных образцов, таких как растения, рыбки данио (взрослые/эмбриональные ), медака, органы мыши/крысы и др.).
Блок флуоресцентного фильтра является основным компонентом флуоресцентной визуализации микроскопа. Он состоит из трех частей: фильтра возбуждения, фильтра излучения и дихроичного светоделителя. Он установлен в фильтрующем колесе. Например, Leica DMi8 оснащена колесиком 6-фильтра положения (рис. 3). Количество положений разных колесиков микроскопа будет разным, и в некоторых микроскопах используются предметные стекла блока фильтров.
Блок фильтров играет важную роль в визуализации флуоресценции: фильтр возбуждения выбирает свет возбуждения для возбуждения образца и блокирует свет других длин волн; свет, проходящий через фильтр возбуждения, проходит через дихроичное зеркало (его функция состоит в том, чтобы отражать свет возбуждения и передавать флуоресценцию). После отражения он фокусируется линзой объектива, облучает образец и возбуждает соответствующую флуоресценцию, т. е. , испускаемый свет. Испускаемый свет собирается линзой объектива, проходит через дихроичный светоделитель и достигает эмиссионного фильтра. Как показано на рисунке 4: длина волны возбуждения составляет 450-490нм, дихроичное зеркало отражает свет с длиной волны короче 510 нм, пропускает свет с длиной волны более 510 нм, а диапазон приема излучаемого света составляет 520-560нм.
