Каково назначение конфокального микроскопа?
1. После усилий и усовершенствований наших великих предшественников оптический микроскоп достиг совершенства. На самом деле обычные микроскопы могут просто и быстро предоставить нам красивые микроскопические изображения. Однако произошло событие, которое принесло революционные инновации в этот почти совершенный мир микроскопов, а именно изобретение «лазерного сканирующего конфокального микроскопа». Особенностью этого нового типа микроскопа является то, что он использует оптическую систему, которая извлекает информацию об изображении только на той поверхности, где сосредоточен фокус, и восстанавливает полученную информацию в памяти изображения при изменении фокуса, так что можно получить полную трехмерную информацию. полученный. Яркий образ интеллекта. С помощью этого метода можно легко получить информацию о форме поверхности, которую невозможно подтвердить с помощью обычного микроскопа. Кроме того, для обычных оптических микроскопов «увеличение разрешения» и «углубление глубины резкости» являются противоречивыми условиями, особенно при больших увеличениях, это противоречие проявляется сильнее, а в условиях конфокальных микроскопов эта проблема легко решается.
2. Преимущества конфокальной оптической системы
Принципиальная схема лазерного конфокального микроскопа
Конфокальная оптическая система осуществляет точечное освещение образца, а отраженный свет также принимается точечным приемником. Когда образец находится в положении фокуса, почти весь отраженный свет может достичь фоторецептора, а когда образец находится не в фокусе, отраженный свет не может достичь фоторецептора. То есть в конфокальной оптической системе будет выводиться только то изображение, которое совпадает с фокальной точкой, а световые пятна и бесполезный рассеянный свет будут экранированы.
3. Зачем использовать лазер?
В конфокальной оптической системе образец освещается в точке, а отраженный свет также принимается точечным фоторецептором. Поэтому становится необходимым точечный источник света. Лазеры являются очень точечными источниками света. В большинстве случаев в качестве источников света для конфокальных микроскопов используются лазерные источники света. Кроме того, характеристики монохроматичности, направленности и превосходной формы луча лазера также являются важными причинами его широкого распространения.
4. Становится возможным наблюдение в реальном времени на основе высокоскоростного сканирования
Для лазерного сканирования в горизонтальном направлении используется активируемый акустикой оптический отклоняющий блок (Acoustic Optical Deflector, AO element), а в вертикальном — Servo Galvano-зеркало. Поскольку акустооптический отклоняющий блок не имеет механической вибрационной части, он может выполнять высокоскоростное сканирование и возможно наблюдение в реальном времени на экране монитора. Эта высокоскоростная визуализация является очень важным элементом, который напрямую влияет на скорость фокусировки и поиска положения.
5. Связь между положением фокуса и яркостью
В конфокальной оптической системе яркость образца максимальна при правильном размещении образца в фокальном положении, а его яркость будет резко уменьшаться до и после него (сплошная линия на рис. 4). Чувствительная избирательность фокальной плоскости также является принципом определения направления высоты конфокального микроскопа и увеличения глубины фокуса. Напротив, обычные оптические микроскопы не имеют значительных изменений яркости до и после положения фокуса.
6. Высокая контрастность, высокое разрешение
В обычных оптических микроскопах из-за интерференции отраженного света от фокусирующей части он перекрывается с частью, отображающей фокус, что приводит к снижению контрастности изображения. С другой стороны, в конфокальной оптической системе рассеянный свет вне фокальной точки и рассеянный свет внутри объектива почти полностью удаляются, так что можно получить изображение с очень высокой контрастностью. Кроме того, поскольку свет дважды проходит через линзу объектива, точечное изображение сначала обостряется, что также улучшает разрешающую способность микроскопа.
7. Функция оптической локализации
В конфокальной оптической системе отраженный свет, кроме точки, совпадающей с фокальной точкой, экранируется микропорой. Поэтому при наблюдении трехмерного образца изображение формируется так, как будто образец срезан фокальной плоскостью (рис. 5). Этот эффект известен как оптическая локализация и является одной из особенностей конфокальных оптических систем.
8. Фокусируйте функцию мобильной памяти
Так называемый отраженный свет за пределами фокальной точки экранируется микропорами. С другой стороны, можно считать, что все точки изображения, формируемого конфокальной оптической системой, совпадают с фокальной точкой. Поэтому, если трехмерный образец перемещать по оси Z (оптической оси), изображения накапливаются и сохраняются в памяти, и в итоге будет получено изображение, сформированное всем образцом и фокальной точкой. Функция бесконечного углубления глубины фокусировки таким образом называется функцией подвижной памяти.
9. Функция измерения формы поверхности
Что касается функции смещения фокуса, то форму поверхности образца можно измерить бесконтактным способом, добавив схему регистрации высоты поверхности. На основе этой функции можно записать координаты оси Z, образованные максимальным значением яркости в каждом пикселе, и на основе этой информации можно получить информацию, относящуюся к форме поверхности образца.
10. Функция высокоточного измерения микроразмеров
В светоприемном блоке используется 1-размерный ПЗС-датчик изображения, поэтому на него не влияет наклон сканирования сканирующего устройства, что позволяет выполнять высокоточные измерения. Кроме того, за счет использования функции памяти сдвига фокуса с регулируемой глубиной фокусировки (углублением) можно устранить ошибку измерения, вызванную смещением фокуса.
11. Трехмерный анализ изображений
С помощью функции измерения формы поверхности можно легко создать трехмерное изображение поверхности образца. Не только это, но также может выполнять различные анализы, такие как: измерение шероховатости поверхности, площадь, объем, площадь поверхности, округлость, радиус, максимальная длина, периметр, центр тяжести, томографическое изображение, преобразование БПФ, измерение ширины линии и т. д. .
Лазерный конфокальный сканирующий микроскоп можно использовать не только для наблюдения за морфологией клеток, но и для количественного анализа внутриклеточных биохимических компонентов, статистики оптической плотности и измерения морфологии клеток.
