Что такое двухфотонная флуоресцентная микроскопия?
Основной принцип двухфотонного возбуждения заключается в следующем: в случае высокой плотности фотонов флуоресцентные молекулы могут одновременно поглощать два длинноволновых фотона и излучать более коротковолновый фотон после короткого периода так называемого времени жизни в возбужденном состоянии. . ; эффект такой же, как при использовании фотона, длина волны которого составляет половину длинной волны, для возбуждения флуоресцентной молекулы. Двухфотонное возбуждение требует высокой плотности фотонов. Чтобы не повредить клетки, в двухфотонной микроскопии используются высокоэнергетические импульсные лазеры с синхронизацией мод. Лазер, излучаемый этим лазером, имеет высокую пиковую энергию и низкую среднюю энергию, ширина его импульса составляет всего 100 фемтосекунд, а частота может достигать 80-100 мегагерц. При использовании объектива с высокой числовой апертурой для фокусировки фотонов импульсного лазера плотность фотонов в фокальной точке объектива самая высокая, и двухфотонное возбуждение происходит только в фокальной точке объектива, поэтому двухфотонный микроскоп не нуждается в конфокальной диафрагме, что повышает эффективность обнаружения флуоресценции.
В общих явлениях флуоресценции из-за низкой плотности фотонов возбуждающего света флуоресцентная молекула может одновременно поглощать только один фотон, а затем испускать флуоресцентный фотон через излучательный переход, который является однофотонной флуоресценцией. В процессе возбуждения флуоресценции с использованием лазера в качестве источника света может возникать двухфотонная или даже многофотонная флуоресценция. В это время интенсивность используемого источника света возбуждения высока, а плотность фотонов соответствует требованиям флуоресцентных молекул, поглощающих два фотона одновременно. В процессе использования обычного лазера в качестве источника возбуждающего света плотность фотонов все еще недостаточна для возникновения явления двухфотонного поглощения. Обычно используется фемтосекундный импульсный лазер, мгновенная мощность которого может достигать порядка мегаватт. Следовательно, длина волны двухфотонной флуоресценции короче длины волны возбуждающего света, что эквивалентно эффекту, производимому возбуждением на половине длины волны возбуждения.
