Зачем мне нужен конфокальный микроскоп?
1. Оптический микроскоп был усовершенствован благодаря усилиям и усовершенствованиям наших великих предшественников. Фактически, обычный микроскоп может легко и быстро предоставить нам красивые микроскопические изображения. Однако событием, которое произвело революцию в мире почти идеальных микроскопов, стало изобретение «лазерного сканирующего конфокального микроскопа». Этот новый тип микроскопа характеризуется оптической системой, которая извлекает информацию об изображении только с той поверхности, на которой сосредоточен фокус, а изменяя фокус при восстановлении полученной информации в памяти изображений, можно получить четкое изображение с полная 3-размерная информация. Таким образом можно легко получить информацию о форме поверхности, которую невозможно подтвердить с помощью обычного микроскопа. Кроме того, хотя «увеличение разрешения» и «углубление глубины резкости» являются противоречивыми условиями для обычных оптических микроскопов, особенно при большом увеличении, эта проблема решается с помощью конфокальных микроскопов.
2. Преимущества конфокальной оптической системы
Принципиальная схема лазерного конфокального микроскопа
Конфокальная оптическая система представляет собой точечное освещение образца, при этом отраженный свет также принимается с помощью точечного рецептора. Когда образец помещен в фокус, почти весь отраженный свет достигает фоторецептора, а когда образец не в фокусе, отраженный свет не может достичь фоторецептора. Другими словами, в конфокальной оптической системе выводится только то изображение, которое совпадает с точкой фокуса, а пятна и бесполезный рассеянный свет блокируются.
3. Зачем использовать лазер?
В конфокальной оптической системе образец освещается в определенной точке, а отраженный свет принимается точечным датчиком. Поэтому необходим точечный источник света. Лазеры во многом являются точечным источником света. В большинстве случаев источником света для конфокальных микроскопов является лазерный источник света. Кроме того, монохроматичность, направленность и отличная форма луча лазеров являются важными причинами их широкого распространения.
4. Возможно наблюдение в реальном времени на основе высокоскоростного сканирования.
Для лазерного сканирования в горизонтальном направлении используется акусто-оптический отклоняющий блок (Acoustic Optical Deflector, AO prime), а в вертикальном — зеркало сканирования луча с сервоэлектронным управлением (Servo Galvano-mirror). Поскольку в АО-дефлекторе отсутствует механическая вибрация, возможно высокоскоростное сканирование и наблюдение в реальном времени на экране монитора. Высокая скорость работы этой камеры – очень важный параметр, который напрямую влияет на скорость фокусировки и восстановления позиции.
5. Связь между положением фокуса и яркостью
В конфокальной оптической системе образец правильно располагается в фокальном положении, когда яркость велика, спереди и сзади его яркость будет резко снижена (рис. 4, сплошная линия). Эта чувствительная избирательность фокальной плоскости лежит в основе ориентации конфокального микроскопа по высоте и расширения глубины фокуса. Напротив, обычные оптические микроскопы не показывают каких-либо существенных изменений яркости до и после положения фокуса (пунктирная линия на рис. 4).
6. Высокая контрастность, высокое разрешение
В обычном оптическом микроскопе отраженный свет от расфокусированной части микроскопа интерферирует с фокальной частью микроскопа и перекрывается с ней, что приводит к уменьшению контрастности изображения. Напротив, в конфокальной оптической системе рассеянный свет за пределами фокуса и внутри объектива почти полностью удаляется, в результате чего изображения получаются с очень высокой контрастностью. Кроме того, разрешающая способность микроскопа повышается, поскольку свет дважды проходит через объектив, увеличивая резкость изображения точки.
7. Функция оптической локализации.
В конфокальной оптической системе отраженный свет экранируется микроапертурой в точке, отличной от фокальной точки. В результате при наблюдении трехмерного образца изображение формируется так, как если бы образец был срезан фокальной точкой (рис. 5). Этот эффект называется оптической локализацией и является одной из особенностей конфокальных оптических систем.
