Особенности и применение конфокальной лазерной микроскопии
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (LSCM) — это тип микроскопа, разработанный на основе технологии сопряженного фокуса, то есть для того, чтобы источник лазерного излучения, тестируемый образец и детектор находились в сопряженном положении друг друга.
Фундаментальный
В обычных микроскопах фокальная плоскость объектива совпадает с детектором, так что наблюдаемая плоскость изображения изолирована от соседней осевой плоскости, в то время как в конфокальных микроскопах образец освещается с помощью светового пятна с ограничением дифракции, а в Этот эффект изоляции достигается за счет использования точечного отверстия на пути сбора света в фокусе сопряженного пятна для фильтрации рассеянного света для улучшения разрешения.
Особенности изображения
Только свет, отраженный обратно от сопряженного слоя образца, может пройти через маленькое отверстие на пути собирающего света, а оставшиеся нерелевантные отражения слоя образца блокируются маленьким отверстием. Это может привести к значительному увеличению разрешения. Ниже показано параллельное сравнение многомерной флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии одного и того же толстого образца. Когда серия изображений делается в разных фокальных плоскостях, может быть сгенерировано то, что обычно называют «z-стеком», и это изображение показывает как увеличение разрешения и контраста, обеспечиваемое конфокальной микроскопией, так и основные причины этого усиления. Изучение изображения в верхней части стопки с плоскостью изображения над тканью показывает много рассеянного света на флуоресцентном изображении, тогда как конфокальное изображение выглядит черным. Это уменьшение PSF в аксиальном направлении непосредственно отвечает за разницу в разрешении, наблюдаемую на оптическом интерфейсе в середине z-стека.
Еще одна особенность лазерной сканирующей конфокальной микроскопии заключается в том, что это технология сканирующей визуализации. Традиционная технология широкопольного освещения освещает весь образец, поэтому изображение может быть получено непосредственно невооруженным глазом или детектором, но LSCM использует луч или несколько сфокусированных лучей, проходящих через образец для сканирования и визуализации, и результирующее изображение называется оптическим сечением. Ниже показано различие между традиционным методом широкопольного освещения и методом конфокального освещения с лазерным сканированием.
Поэтому практический метод работы современного конфокального микроскопа показан на рисунке ниже. Возбуждающий свет, излучаемый лазером, проходит через дихроичное зеркало и сканирует образец в направлениях x и y через пару вибрирующих зеркал. Возбуждение (или отражение) образца Свет попадает в детектор ФЭУ через точечное отверстие и записывается, а записанное сканированное изображение восстанавливается компьютером для получения фактического изображения образца.
