Применение концепции современного микроскопа в наблюдении микроскопического мира
С древних времен и до наших дней люди стремились к более высоким и далеким истинам. От океанских путешествий до освоения космоса люди добивались великих целей одну за другой. Однако макроскопический мир, который люди видят невооруженным глазом, — это не весь мир, и человеческий глаз не может видеть его ясно. Это также привлекает бесчисленное количество людей, чтобы исследовать и преследовать.
Вне зависимости от того, макроскопические или микроскопические вещи, наши наблюдения основаны на атрибутах трехмерного пространства, то есть XYZ трехмерного, и наблюдение за изменением формы вещей требует введения еще одного фактора измерения — времени Т, поэтому наиболее полным способом наблюдения за вещами должна быть одновременная запись XYZT, то есть долговременное фотографирование формы плюс время, также является конечной функцией микроскопа.
После более чем 300-летнего развития современные микроскопы предложили такие понятия, как разрешение, глубина резкости и поле зрения, и постоянно предлагали решения. Микроскопы изначально удовлетворяли наши потребности в наблюдении за микроскопическим миром и помогали нам регистрировать пространство и время в микроскопическом мире.
Самое главное в микроскопическом наблюдении за миром — это разрешение деталей, и отсюда родилось понятие разрешения. Разрешение относится к минимальному расстоянию между двумя точками, которое может быть различимо человеческим глазом, и допустимо только в измерении XY. Согласно критерию Рэлея, критерию Рэлея, предел, который могут различить нормальные люди, составляет две точки 0,2 мм на расстоянии 25 см. Когда мы используем микроскоп, мы можем видеть две точки на меньшем расстоянии, что улучшает разрешение нашего наблюдения. С непрерывным углублением современных исследований требования людей к разрешающей способности также постоянно возрастают, и ученые также постоянно улучшают разрешающую способность микроскопов. Например, электронные микроскопы увеличили разрешение до нанометрового уровня, что позволяет наблюдать за вирусами. Технология сверхвысоких микроскопических изображений улучшает разрешение микроскопа с 200 нанометров до десятков нанометров, позволяя наблюдать за органеллами живых клеток.
Улучшение разрешения также приносит новые проблемы, то есть уменьшение поля зрения и глубины резкости. При использовании обычного метода центрального освещения (метод фотопического освещения, благодаря которому свет равномерно проходит через образец) расстояние разрешения микроскопа составляет d=0,61 λ/NA, диапазон длин волн видимого света составляет { {2}}нм, средняя длина волны составляет 550 нм, а длина волны является фиксированной константой. Следовательно, увеличивая значение NA, можно получить меньшее значение D, то есть расстояние между двумя точками, которые можно различить Меньше, что позволяет людям четко видеть более мелкие объекты.
Значение NA представляет собой числовую апертуру, которая описывает размер угла светоприемного конуса линзы, NA=n * sin , то есть произведение показателя преломления (n) среды между линзой и досматриваемый объект и синус половины апертурного угла (2). n — показатель преломления света среды между линзой объектива и образцом. Когда космической средой объекта микроскопа является воздух, показатель преломления n=1. Использование среды с более высоким показателем преломления, чем у воздуха, может значительно увеличить значение числовой апертуры. Среда водной иммерсии - дистиллированная вода, коэффициент преломления - 1,33; масляная иммерсионная среда объектива представляет собой кедровое масло или другие прозрачные масла, а его показатель преломления обычно составляет около 1,52, что близко к показателю преломления линзы и предметного стекла. Следовательно, числовая апертура масляной линзы выше, чем у воздушной линзы.
Угол апертуры, также известный как «угол рта зеркала», представляет собой угол, образованный точкой объекта на оптической оси объектива и эффективным диаметром передней линзы объектива. Увеличение угла рта зеркала может увеличить значение синуса, и его фактический верхний предел составляет около 72 градусов (значение синуса 0,95), умноженное на показатель преломления кедрового масла 1,52, можно получить, что максимальное значение числовой апертуры составляет около 1,45, и подставляя его в формулу расчета разрешения, можно получить, что предельное разрешение плоскости XY обычного микроскопа составляет около 0,2 мкм.
Значение NA также напрямую влияет на яркость поля зрения микроскопа (B). Из формулы B∝NA2/M2 можно сделать вывод, что яркость увеличивается с увеличением числовой апертуры (NA) или уменьшением увеличения объектива (M).
Теоретически мы должны добиваться максимально возможного значения числовой апертуры, чтобы получить лучшее разрешение в плоскости XY и яркость поля зрения. Однако у всего есть две стороны. Улучшение разрешения в плоскости XY уменьшит глубину резкости по оси Z и поле зрения наблюдения.
Микроскопы обычно рассматривают вид вертикально вниз. Когда выпуклое положение и вогнутое положение на поверхности объекта, наблюдаемого в пределах диаметра поля зрения, можно ясно увидеть, тогда разница высот между выпуклой точкой и вогнутой точкой является глубиной резкости. Ну а для микроскопов чем больше глубина резкости, тем лучше. Чем больше глубина резкости, тем более качественное и четкое трехмерное изображение можно получить при наблюдении за поверхностью неровных объектов. Большая глубина резкости помогает нам наблюдать микроскопический мир в вертикальном направлении. То есть информация по оси Z в трехмерной форме XYZ.
Глубина резкости — это глубина переднего и заднего пространства, соответствующая четкому изображению на плоскости изображения: dtot=(λ*n)/NA плюс n/(M∗NA) * e, dtot: глубина резкости , NA: числовая апертура, M: общее увеличение, λ: длина волны света (обычно λ=0,55 мкм), n: показатель преломления среды между образцом и линзой объектива (воздух: n{{3 }}, масло: n=1.52) Согласно этой формуле, мы можем узнать, что глубина резкости по оси Z обратно пропорциональна значению NA плоскости XY.
В дополнение к глубине резкости на поле зрения также влияет значение NA. Пространственный диапазон, который можно увидеть, когда инструмент неподвижно смотрит на точку, называется полем зрения. Его расчет напрямую связан с увеличением объектива. Действительный диаметр поля зрения, наблюдаемый при наблюдении, равен диаметру поля зрения. Разделенный на увеличение объектива, окуляр укажет соответствующее поле зрения, например 10/18, т. е. увеличение 10 крат, диаметр поля зрения 18 мм. Поэтому при определении окуляра чем больше увеличение, тем меньше наблюдаемое поле зрения.
Разрешение плоскости XY — это анализ локальных деталей, а поле зрения определяет дальность наблюдения за образцом. Чем больше поле зрения, тем лучше, но, ограниченные современной технологией, мы должны использовать линзы с большим увеличением, чтобы получить хорошие значения числовой апертуры, поэтому значения поля зрения и числовой апертуры имеют косвенную отрицательную корреляцию.
