Отличия и характеристики флуоресцентных микроскопов от обычных оптических микроскопов
Флуоресцентный микроскоп отличается от обычного оптического микроскопа тем, что он не наблюдает образцы при освещении обычными источниками света. Вместо этого он использует свет определенной длины волны (обычно ультрафиолетовый свет, сине-фиолетовый свет) для возбуждения флуоресцентных веществ внутри образца под микроскопом, заставляя их излучать флуоресценцию. Таким образом, роль источника света во флуоресцентном микроскопе заключается не в прямом освещении, а в качестве источника энергии для возбуждения флуоресцентных веществ внутри образца. Причина, по которой мы можем наблюдать образцы, связана не с освещением источника света, а с явлением флуоресценции, проявляемым флуоресцентными веществами внутри образца после поглощения энергии возбужденного света. Отсюда видно, что характеристикой флуоресцентной микроскопии является главным образом то, что ее источник света может подавать большое количество возбуждающего света в определенном диапазоне длин волн, так что флуоресцентные вещества в образце могут получить необходимую интенсивность возбуждающего света. В то же время флуоресцентные микроскопы должны иметь соответствующие системы фильтров. Флуоресцентный микроскоп является фундаментальным инструментом флуоресцентной химии тканей. Он состоит из основных компонентов, таких как источник света сверх-высокого напряжения, система фильтров (включая фильтрующие пластины возбуждения и подавления), оптическая система и система фотографирования. Он использует свет определенной длины волны для возбуждения образца и излучения флуоресценции.
1. Методы возбуждения флуоресценции. В зависимости от диапазона длин волн света существует два типа: метод УФ-возбуждения (с использованием ультрафиолетового освещения) и метод БВ-возбуждения (с использованием сине-фиолетового света). Метод УФ-возбуждения использует для возбуждения ближний ультрафиолетовый свет длиной менее 400 нм. В этом методе отсутствует видимый возбуждающий свет, поэтому наблюдаемая флуоресценция демонстрирует собственную флуоресценцию красителя, что позволяет легко отличить специфическую флуоресценцию на образце от собственной флуоресценции фоновой ткани.
2. Метод BV-возбуждения: он включает возбуждение от ультрафиолетового до синего света с длиной волны 404 нм и 434 нм. В этом методе для облучения образца используется синий свет, поэтому отсекающий-фильтр системы наблюдения флуоресценции должен использовать фильтр, который может полностью блокировать синий свет и полностью проходить через необходимую зеленую и желтую флуоресценцию. Флуоресцентные пигменты, используемые для метода флуоресцентных антител. Максимальная длина волны поглощения возбуждающего света и максимальная длина волны излучения флуоресценции относительно близки, поэтому фильтр, используемый в методе возбуждения BV, должен использовать фильтр с резкой резкостью. Этот метод может использовать синий свет в качестве возбуждающего света, поэтому эффективность поглощения флуоресцентных пигментов высока и можно получить более яркие изображения. Недостатком является то, что флуоресценцию ниже 500 нм невозможно увидеть, а флуоресценция выше 500 нм делает все изображение желтым. В методе флуоресцентных антител специфичность в основном определяется цветом, уникальным для флуоресцентных пигментов, поэтому при обсуждении тонкой специфичности недостатки метода возбуждения BV, упомянутые выше, часто оказывают значительное влияние.
