Как выбрать правильный конфокальный микроскоп? Есть какой-то конкретный метод?
Конфокальная микроскопия имеет больше преимуществ, чем широкопольная микроскопия. Конфокальная микроскопия позволяет делать непрерывные оптические срезы образцов и исключать интерференцию сигналов из нефокальных плоскостей. По этой причине применение конфокальной микроскопии действительно более распространено. Однако на рынке появляется все больше и больше конфокальных микроскопов. Как выбрать?
Конфокальная микроскопия имеет больше преимуществ, чем широкопольная микроскопия. Конфокальная микроскопия позволяет делать непрерывные оптические срезы образцов и исключать интерференцию сигналов из нефокальных плоскостей. По этой причине конфокальная микроскопия действительно более распространена. Однако на рынке появляется все больше и больше конфокальных микроскопов. Как выбрать? При выборе конфокального микроскопа необходимо учитывать два основных и важных фактора: тип образца, который вы хотите исследовать (например, фиксированные или живые клетки), и тип анализа, который вы хотите выполнить (например, статические или динамические клеточные процессы).
Конфокальная визуализация фиксированных клеток
Для изображения фиксированных и окрашенных клеток или тканей мы обычно выбираем конфокальное лазерное сканирование (LSCM). Это в основном связано с тем, что фиксированным мертвым клеткам не хватает быстрых биологических событий в живых клетках, и они могут лучше использовать более высокое пространственное разрешение LSCM. Визуализация LSCM предназначена для оптического среза образца с помощью лазера, а скорость сканирования (в зависимости от скорости зеркала сканирующей матрицы) обычно составляет 1 кадр в секунду. Более длительное время экспозиции означает больший риск фотообесцвечивания, но для фиксированных мертвых клеток время не имеет решающего значения, и мы можем усреднить его, сделав несколько снимков.
Конфокальная визуализация живых клеток
Визуализация живых клеток требует дополнительной защиты от неблагоприятной среды. При визуализации наше первое соображение заключается в поддержании жизнеспособности и здоровья клеток. Нагревательные элементы с постоянной температурой и перфузионные системы имеют важное значение, особенно для исследований с интервальной съемкой. Быстрые биохимические события, которые контролируют физиологическое состояние живых клеток, — это то, что большинство людей хотят изучать, но эти события слишком быстры для обычного LSCM. Кроме того, длительное воздействие LSCM также вызывало токсическое повреждение клеток светом. Поэтому для визуализации живых клеток требуются специальные конфокальные микроскопы.
Обычно существует два варианта конфокальной визуализации живых клеток: конфокальные изображения с быстрым лазерным сканированием и конфокальные изображения с вращающимся диском. Конфокальная микроскопия с быстрым сканированием заменяет более медленные гальванометрические зеркала более быстрыми резонансными сканирующими зеркалами, обеспечивая скорость сканирования до 30 кадров в секунду; в то время как конфокальные датчики с вращающимся диском (SDCM) имеют преимущество в более быстром сканировании (хотя и неизбежно с потерей пространственного разрешения), его скорость теоретически может достигать 2000 кадров в секунду (на практике она часто ограничивается другими факторами).
Если вас беспокоит фотообесцвечивание или очень слабый сигнал флуоресценции, тогда SDCM может быть более подходящим. SDCM использует два вращающихся диска с расположенными в ряд микролунками для рассеивания возбуждающего света. В отличие от LSCM, который сканирует пятно образца, SDCM получает несколько пятен за раз (около 100 пиксельных пятен), поэтому скорость значительно увеличивается, а фотообесцвечивание SDCM и меньшая фототоксичность. Однако вы также можете использовать быстросканирующие конфокальные линзы для увеличения скорости сканирования в сочетании с высокочувствительными детекторами и уменьшать энергию возбуждающего света для снижения фототоксичности, что может поддерживать богатые функции традиционных конфокальных линз.
Автоматизированная система конфокальной визуализации
Некоторым исследователям нравится находить способы модифицировать микроскоп в соответствии со своими индивидуальными потребностями. А некоторых исследователей даже не интересует, как на самом деле работают микроскопы. Для последних им может больше понравиться автоматизированный конфокальный микроскоп. Например, Olympus FluoViewFV10i представляет собой полностью автоматический настольный 4-лазерный конфокальный микроскоп. Его компактная интегрированная структура практически не требует места для установки. Этот тип инструментов идеально подходит для исследователей, которым необходимо ежедневно получать большое количество данных изображений, но, конечно, они не в полной мере отражают функциональность и гибкость традиционных конфокальных линз. Кроме того, NikonA1 также является полностью автоматической конфокальной системой. Как и в большинстве обычных конфокальных сканирующих микроскопов, в NikonA1 используется сканирующая головка гальванометра, которая имеет более высокое разрешение, чем A1R с гибридной сканирующей головкой, но немного меньшую скорость (A1R ~ 30 кадров в секунду).
