Принципы флуоресцентной микроскопии
Флуоресцентные микроскопы отличаются от обычных оптических микроскопов. Вместо того, чтобы наблюдать образцы при освещении обычными источниками света, они используют свет определенной длины волны (обычно ультрафиолетовый свет, сине-фиолетовый свет) для возбуждения флуоресцентных веществ в образцах под микроскопом, чтобы они излучали флуоресценцию. Таким образом, источник света флуоресцентного микроскопа действует не как прямое освещение, а как источник энергии, который возбуждает флуоресцентные вещества внутри образца. Причина, по которой мы можем наблюдать образец, заключается в освещении источника света, но явление флуоресценции возникает после того, как флуоресцентное вещество в образце поглощает энергию возбужденного света.
Можно видеть, что характеристика флуоресцентного микроскопа заключается в том, что его источник света может подавать большое количество возбуждающего света в определенном диапазоне длин волн, так что флуоресцентное вещество в испытуемом образце может получать возбуждающий свет необходимой интенсивности. В то же время флуоресцентный микроскоп должен иметь соответствующую систему фильтров.
Флуоресцентная микроскопия является важным инструментом иммунофлуоресцентной гистохимии. Он состоит из сверхвысоковольтного источника света, системы фильтров (включая фильтровальную пластину возбуждения и подавления), оптической системы, системы фотографирования и других основных компонентов. Он использует свет определенной длины волны, чтобы возбудить образец для испускания флуоресценции.
Способ возбуждения флуоресценции: В зависимости от диапазона длин волн света его можно разделить на два типа: метод УФ-возбуждения (с использованием метода ультрафиолетового освещения) и метод возбуждения BV (с использованием сине-фиолетового света). В методе УФ-возбуждения для возбуждения используется ближний ультрафиолетовый свет с длиной волны короче 400 нм. В этом методе нет видимого возбуждающего света, поэтому наблюдаемая флуоресценция представляет собой флуоресценцию, присущую красителю, и легко отличить специфическую флуоресценцию на образце от автофлуоресценции фоновой ткани.
Метод возбуждения BV основан на 404 нм и 434 нм для возбуждения от ультрафиолетового до синего света. В этом методе для облучения образца используется синий свет, поэтому в отсекающем фильтре системы наблюдения флуоресценции должен использоваться фильтр, который может полностью блокировать синий свет и полностью пропускать требуемую зеленую и желтую флуоресценцию. Флуоресцентные красители для флуоресцентных анализов антител. Максимальная длина волны поглощения возбуждающего света относительно близка к максимальной длине волны излучения флуоресценции, поэтому фильтр, используемый в методе возбуждения BV, должен использовать фильтр с резкой отсечкой. Этот метод может использовать синий свет в качестве света возбуждения, поэтому эффективность поглощения флуоресцентного пигмента выше, и можно получить более яркое изображение. Его недостатком является то, что флуоресценция ниже 500 нм не видна, а флуоресценция выше 500 нм делает все изображение желтым. В методе флуоресцентных антител о специфичности флуорохрома часто судят по цвету, уникальному для флуорохрома. Поэтому при обсуждении тонкой специфичности часто имеют большое влияние упомянутые выше недостатки метода возбуждения БВ.
Подводя итог, можно сказать, что освещение флуоресцентного микроскопа можно рассматривать в соответствии со следующими тремя пунктами в зависимости от конструкции конденсора и длины волны возбуждающего света.
① С точки зрения требований к контрастности флуоресцентного изображения для освещения используется концентратор темного поля УФ-возбуждения.
② Учитывая яркость изображения, фильтр возбуждения BV имеет самую высокую эффективность наблюдения темного поля.
③Характеристики наблюдения темного поля с фильтром УФ-возбуждения и освещения концентратора темного поля возбуждения BV можно рассматривать как нечто среднее между этими двумя методами освещения, но первый обладает более сильными свойствами темного поля и отображает более яркие изображения. Контраст небольшой; последний сохраняет свойства темнопольного светового пути, поэтому отображаемое изображение темнее, а контрастность улучшается. При использовании флуоресцентного микроскопа для наблюдения следует использовать тот метод освещения, который лучше всего соответствует требованиям к образцу.
Следует отметить, что даже если освещается темнопольный конденсор с УФ-возбуждением с наилучшим контрастом, часть УФ-света возбуждения, преломленного или рассеянного образцом, попадет в линзу объектива. Автофлуоресценция может ухудшить реакцию изображения. Поэтому перед окуляром в качестве отсекающего фильтра необходимо использовать УФ-поглощающий фильтр.
