Требования к подготовке образцов для флуоресцентной микроскопии
Требования к подготовке препаратов для флуоресцентной микроскопии
(1) Предметное стекло
Толщина предметного стекла должна быть в пределах 0.8-L2 мм. Слишком толстое предметное стекло, с одной стороны, будет поглощать больше света, а с другой стороны, не сможет сфокусировать возбуждающий свет на образце. Слайды должны быть гладкими, однородными по толщине и не иметь явно выраженной аутофлуоресценции. Иногда используются кварцевые горки.
(2) Защитное стекло
Толщина покровного стекла составляет около 0,17 мм, гладкое. Для усиления возбуждающего света также можно использовать интерференционное покровное стекло, которое представляет собой специальное покровное стекло, покрытое несколькими слоями веществ (таких как фторид магния), оказывающих различное интерференционное воздействие на свет с разными длинами волн, что может сделать флуоресценция гладкая. Возбуждающий свет проходит, и возбуждающий свет отражается, и этот отраженный возбуждающий свет может возбудить образец.
(3) Образец
Срезы ткани или другие образцы не должны быть слишком толстыми. Если толщина слишком велика, большая часть возбуждающего света будет потребляться в нижней части образца, в то время как верхняя часть, непосредственно наблюдаемая объективом, не может быть полностью возбуждена. Кроме того, на оценку влияет флуоресценция, вызванная перекрывающимися клетками или примесями, фоновое неспецифическое окрашивание.
(4) зеркальное масло
Как правило, при наблюдении образцов с помощью флуоресцентных микроскопов темного поля и масляных иммерсионных микроскопов необходимо использовать иммерсионное масло. Лучше всего использовать специальное нефлуоресцентное иммерсионное масло. Вместо него также можно использовать глицерин, а также жидкий парафин, но показатель преломления у него низкий, что незначительно влияет на качество изображения.
Понимание светового куба флуоресцентной микроскопии
Флуоресценция — это свет, который электроны в веществе поглощают световой энергией из низкоэнергетического состояния в высокоэнергетическое состояние, а затем испускают свет, когда он возвращается в низкоэнергетическое состояние. Это нетемпературный излучаемый свет — люминесценция. То есть: вещество поглощает коротковолновый свет, переходит в возбужденное состояние и излучает длинноволновый свет.
Будь то аутофлуоресценция вещества, флуоресцентного красителя или флуоресцентного белка, выраженная путем слияния, ее необходимо возбуждать светом определенной длины волны (возбуждение). После того, как электроны мигрируют и теряют энергию, они излучают свет определенной длины волны (излучение). , которые могут быть собраны системой обнаружения для достижения функции определения специфической флуоресценции.
Что такое люминесцентный световой куб?
При наблюдении и визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа свет возбуждения с определенной длиной волны и соответствующий длинноволновый испускаемый свет обеспечиваются световым кубом флуоресценции, так что сигнал флуоресценции может быть получен невооруженным глазом, экраном дисплея или камерой. Таким образом, световой куб флуоресценции определяет, что может быть обнаружено. Ключевое устройство флуоресцентного сигнала, его характеристики включают EX: параметры фильтра длины волны возбуждения, EM: параметры фильтра длины волны излучения и DM: параметры дихотомического зеркала. В качестве примера возьмем световой куб DAPI интегрированного флуоресцентного микроскопа Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >свет с длиной волны 425 нм может передаваться на ЭМ; Эмиссионные фильтры ЭМ используются для отделения флуоресценции, испускаемой флуорофором, от других фоновых оптических элементов. Эмиссионные фильтры пропускают свет на длине волны флуоресценции через дихроичное зеркало, блокируя весь другой свет, который просачивается от источника возбуждающего света (отраженный от образца или оптики). Длина волны излучаемого света больше наблюдаемой ЭМ, то есть в систему обнаружения попадает только свет в диапазоне 450 ± 25 нм. Правильный выбор дихотомий EX, EM и DM может помочь исследователям достичь более высокого отношения сигнал/шум (S/N).
