Методы окрашивания и микроскопическое наблюдение микроорганизмов
Простое окрашивание бактерий
1 Цели
1.1 Изучить основные приемы микробного мазка и окраски.
1.2 Освоить простой метод окраски бактерий.
1.3 Познакомиться с морфологическими особенностями бактерий, закрепить знания по использованию масляного зеркала и технике асептических операций.
2 Принцип Мазок и окрашивание бактерий являются основным методом микробиологических экспериментов. Клетки бактерий мелкие и прозрачные, их нелегко распознать под обычным световым микроскопом, и их необходимо окрашивать. Использование одного красителя для окрашивания бактерий, чтобы окрашенный организм и фон образовывали четкую разницу в цвете, чтобы можно было более четко наблюдать их морфологию и структуру. Этот метод прост в исполнении и пригоден для наблюдения за общей формой организма и расположением бактерий. Щелочные красители обычно используются для простого окрашивания, поскольку в нейтральных, щелочных или слабокислых растворах бактериальные клетки обычно заряжены отрицательно, а когда щелочные красители ионизируются, окрашивающая часть их молекул заряжается положительно, поэтому окрашивающая часть щелочных красителей может легко связываться с бактериями, придавая бактериям окраску. Окрашенные бактериальные клетки резко контрастируют с фоном и их легче распознать под микроскопом. Обычно используемые красители для простого окрашивания включают мероцианиновый синий, кристаллический фиолетовый и основной красный цвет. Когда бактериальное разложение сахара с образованием кислоты приводит к снижению pH среды, положительный заряд бактерий увеличивается, и тогда их можно использовать для окрашивания красным, кислотным красным или конго красным и другими кислотными красителями. Бактерии должны быть зафиксированы перед окрашиванием. Его цель двоякая: первая — убить бактерии и заставить их прилипнуть к предметному стеклу; второй — повысить его сродство к красителю. Обычно используются два метода: нагревание и химическая фиксация. Постарайтесь сохранить первоначальную морфологию клеток при фиксации.
3 Материала
3.1 Штамм Bacillus subtilis 12-18h культура на скошенном питательном агаре, Staphylococcus aureus около 24 часов на скошенном питательном агаре, Escherichia coli на скошенном 24-часовом питательном агаре, культура на скошенном агаре пекарских дрожжей.
3.2 Окраска Щелочной краситель метиленового синего по Лю (или окраска кристаллическим фиолетовым от оксалата аммония), красная окраска соединением карболовой кислоты.
3.3 Инструменты или другие принадлежности Микроскоп, спиртовка, предметное стекло, инокуляционное кольцо, держатель предметных стекол, двухслойная бутыль (наполненная кедровым маслом и ксилолом), бумага для микроскопа, физиологический раствор или дистиллированная вода и т.п.
4 Процедура Мазок → высушивание → фиксация → окрашивание → промывание → высушивание → микроскопическое исследование.
5 шагов
5.1 Мазок. Возьмите два чистых и обезжиренных предметных стекла, на каждое из которых в асептических условиях наносят небольшую каплю физиологического раствора (или дистиллированной воды) в центре предметного стекла с инокулирующим кольцом для асептической обработки соответственно от Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus. и Escherichia coli наклонно собирают в капле воды немного мха, перемешивают и покрывают пленкой. Если бактериальная суспензия (или жидкая культура) мазка, можно использовать для инокуляции колец, выберите 2-3 кольца непосредственно на предметном стекле. Обратите внимание, что физиологического раствора (дистиллированной воды) и взятых бактерий не должно быть слишком много, они должны распределяться равномерно и не слишком густо.
5.2 Сушка Сушить естественным путем при комнатной температуре. Его также можно высушить, слегка нагрев над спиртовкой покрытой стороной вверх. Однако не приближайтесь слишком близко к огню, поскольку слишком высокая температура разрушит морфологию бактерий.
5.3 Фиксация. При использовании тепловой сушки фиксация и сушка объединяются в один этап так же, как и сушка. Смажьте, высушите и зафиксируйте термофиксацией.
5.4 Окрашивание Поместите предметное стекло на полку для предметных стекол, добавьте 1–2 капли окрашивающего раствора на мазок (при необходимости окрашивающий раствор только покрывает мазок). Окрасьте мазок основным мелланоксовым синим Люя в течение 1–2 минут и карбонатным красным (или кристаллическим фиолетовым из оксалата аммония) в течение примерно 1 минуты.
5.5 Промывание Слейте окрашивающий раствор и осторожно промойте водопроводной водой один конец предметного стекла до тех пор, пока вода, стекающая с мазка, не станет бесцветной. При полоскании не допускайте попадания воды непосредственно на поверхность с покрытием. Поток воды не должен быть слишком быстрым или слишком большим, чтобы избежать смещения мазковой пленки.
5.6 Сушка Стряхните капли воды с предметного стекла, чтобы они высохли естественным путем, для впитывания сухого вещества можно использовать абсорбирующую бумагу или просушить феном (будьте осторожны, чтобы не вытереть тело бактерии). 5.7. Микроскопическое исследование. Мазок высушивают и исследуют под микроскопом. Мазок должен полностью высохнуть, прежде чем его можно будет наблюдать в масляный микроскоп.
6 Результаты. Изобразите морфологию E. coli и Micrococcus garciniae после однократного окрашивания.
Окраска по Граму
1. Цель
1.1 Понять принцип окраски по Граму и ее значение для классификации и идентификации бактерий.
1.2 Изучить и освоить технику окраски по Граму и закрепить навыки пользования масляной линзой светового микроскопа.
