Методы окрашивания и микроскопическое наблюдение микроорганизмов
1. Цель
1.1 Изучите основные методы получения мазков и окрашивания микробов.
1.2 Освоить простой метод окрашивания бактерий.
1.3 Предварительно разобраться в морфологических особенностях бактерий и закрепить знания по использованию масляных линз и технике асептических операций.
2 принципа
Размазывание и окрашивание бактерий — основной метод микробиологических экспериментов. Бактериальные клетки маленькие и прозрачные, что затрудняет их идентификацию под обычным световым микроскопом; они должны быть окрашены. Для окрашивания бактерий используется один краситель, так что окрашенные бактерии образуют четкое цветовое отличие от фона, что позволяет более четко наблюдать их морфологию и структуру. Этот метод прост в использовании и пригоден для наблюдения за общей формой бактериальных клеток и расположением бактерий. Для простого окрашивания обычно используются основные красители. Это связано с тем, что в нейтральных, щелочных или слабокислых растворах бактериальные клетки обычно заряжены отрицательно, а при ионизации основных красителей красящая часть их молекул заряжена положительно, поэтому они являются щелочными. Окрашивающая часть красителя легко соединяется с бактериями, окрашивая их. Окрашенные бактериальные клетки резко контрастируют с фоном, что облегчает их идентификацию под микроскопом. Красители, обычно используемые для простого окрашивания, включают метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин и т. д. Когда бактерии разлагают сахара и выделяют кислоту, вызывая падение pH культуральной среды, положительный заряд бактерий увеличивается. В это время для окрашивания можно использовать кислые красители, такие как эозин, кислый фуксин или конго красный. Бактерии необходимо зафиксировать перед окрашиванием. У него две цели: первая — убить бактерии и заставить их прилипать к предметному стеклу; другой — повысить их сродство к красителям. Двумя наиболее часто используемыми методами являются нагревание и химическая фиксация. При фиксации старайтесь сохранить первоначальную форму ячеек.
3 материала
3.1 Бактерии: Bacillus subtilis 12-18h культура на скошенном питательном агаре, Staphylococcus aureus 24h культура на скошенном питательном агаре, Escherichia coli 24h культура на скошенном питательном агаре, культура на скошенном агаре пекарских дрожжей.
3.2 Краситель: щелочной краситель метиленового синего Лу (или краситель оксалата аммония кристаллический фиолетовый), краситель фуксин карболовой кислоты.
3.3 Инструменты или другая утварь: микроскоп, спиртовка, предметное стекло, инокуляционная петля, штатив для предметных стекол, двухслойная бутыль (содержащая кедровое масло и ксилол), ткань для линз, физиологический раствор или дистиллированная вода и т.п.
4. Процесс: мазок → сушка → фиксация → окрашивание → промывание → сушка → микроскопическое исследование.
5 шагов
5.1. Мазок. Возьмите два чистых и обезжиренных предметных стекла. В стерильных условиях нанесите небольшую каплю физиологического раствора (или дистиллированной воды) на каждый центр предметного стекла. Используйте инокуляционную петлю для стерилизации бактерий Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus и Escherichia coli, выберите в капельках воды на скосе немного бактериального газона, хорошо перемешайте и нанесите тонкой пленкой. Если вы используете мазок с бактериальной суспензией (или жидкой культурой), вы можете использовать инокулирующую петлю, чтобы взять 2–3 петли и нанести их непосредственно на предметное стекло. Будьте осторожны, не пролейте слишком много физиологического раствора (дистиллированной воды) и не удалите бактерии, наносите его равномерно и не слишком густо.
5.2 Сушка Сушить естественным путем при комнатной температуре. Вы также можете слегка нагреть его над спиртовкой стороной с покрытием вверх, чтобы высушить. Но не приближайтесь слишком близко к огню, так как слишком высокая температура разрушит морфологию бактерий.
5.3 Фиксация. При использовании сушки с подогревом фиксация и сушка объединяются в один этап, а метод аналогичен сушке. Смажьте, высушите и зафиксируйте термофиксацией.
5.4 Окрашивание: поместите предметное стекло на подставку для предметных стекол и добавьте 1–2 капли раствора красителя на мазок (при этом раствор красителя должен только покрывать мазок). Окрасьте основным метиленовым синим Лу в течение 1–2 минут и окрасьте фуксином карболовой кислоты (или кристаллическим фиолетовым оксалата аммония) в течение примерно 1 минуты.
5.5 Промывание водой: Слейте раствор красителя и осторожно промойте водопроводной водой один конец предметного стекла до тех пор, пока вода, стекающая с мазка, не станет бесцветной. При мытье водой не мойте поверхность с покрытием непосредственно водой. Поток воды не должен быть слишком быстрым или слишком большим, чтобы предотвратить опадание мазковой пленки.
5.6 Сушка: Стряхните капли воды с предметного стекла и высушите естественным путем, высушите феном или промокните впитывающей бумагой (будьте осторожны, чтобы не вытереть бактерии). 5.7. Микроскопическое исследование. После высыхания мазка проводят микроскопическое исследование. Перед просмотром через масляную линзу мазок должен полностью высохнуть.
6 Результаты. Нарисуйте морфологию E. coli и Micrococcus luteus, наблюдаемую после однократного окрашивания.
