Разница между (двухфотонным, конфокальным) флуоресцентным микроскопом и обычным микроскопом
Основной принцип двухфотонного возбуждения состоит в том, что при высокой плотности фотонов флуоресцентные молекулы могут одновременно поглощать два длинных фотонов длины волны и излучать более короткий фотон длины волны после короткого периода так называемого времени жизни возбужденного состояния; Эффект такой же, как использование фотона с половиной длины волны длинной длины волны, чтобы возбудить флуоресцентные молекулы. Два фотонного возбуждения требует высокой плотности фотонов, и, чтобы избежать повреждения клеток, двухфотонная микроскопия использует высокоэнергетические импульсные лазеры. Лазер, испускаемый этим лазером, имеет высокую пиковую энергию и низкую среднюю энергию, с шириной импульса всего 100 фемтосекунд и частотой до 80-100 мегахерц. При использовании объективного объектива с высокой численной апертурой для фокусировки фотонов импульсного лазера плотность фотонов в фокусной точке объективной линзы является самым высоким, а двухфотонное возбуждение возникает только в фокусной точке объектива объектива. Следовательно, двухфотонный микроскоп не требует конфокальной обшивки, что повышает эффективность обнаружения флуоресценции.
В общих флуоресцентных явлениях, из -за низкой плотности фотонов света возбуждения, флуоресцентная молекула может поглощать только один фотон за раз, а затем излучать еще один флуоресцентный фотон с помощью радиационного перехода, который известен как отдельная флуоресценция. Для процессов возбуждения флуоресценции могут возникнуть лазеры в качестве источников света, двухфотонные или даже многофотонные флуоресцентные явления. В этом случае используемый источник света возбуждения имеет высокую интенсивность и плотность фотонов, что отвечает требованию для флуоресцентных молекул для одновременного поглощения двух фотонов. В процессе использования общего лазера в качестве источника возбуждения света плотность фотонов все еще недостаточна для получения двухфотонного явления поглощения. Как правило, используются фемтосекундные импульсные лазеры, причем мгновенная мощность достигает уровня мегаватта. Следовательно, длина волны двухфотонной флуоресценции короче, чем у света возбуждения, что эквивалентно эффекту, полученному при возбуждении длины волны половины возбуждения.
Знания, связанные с конфокальной флуоресцентной микроскопией
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии состоит в том, чтобы использовать точечный источник света для облучения образца, образуя четко определенное маленькое световое пятно на фокальной плоскости. Флуоресценция, излучаемая из этого места после облучения, собирается объективом и отправляется обратно вдоль исходного пути облучения к разветвлению луча, состоящего из дихроического зеркала. Спектрометр посылает флуоресценцию непосредственно в детектор. Перед источником света и детектором есть шестерна, называемая шнуркой освещения и рукой обнаружения соответственно. Геометрические измерения двух являются последовательными, приблизительно 100-200 нм; По сравнению с световым пятном на фокальной плоскости оба сопряжены, что означает, что световое пятно проходит через серию линз и в конечном итоге может сосредоточиться как на обшивке, так и на обширной руке. Таким образом, свет из фокальной плоскости может сходиться в диапазоне отверстия обнаружения, в то время как рассеянный свет сверх или ниже фокальной плоскости блокируется вне отверстия обнаружения и не может быть отображен. Сканируя точку образца по точке с помощью лазера, фотоумножихарная трубка после обнаружения заглушки также получает соответствующее конфокальное изображение точки точки света за точкой, преобразует ее в цифровой сигнал и передает его на компьютер и, наконец, объединяет его в четкое конфокальное изображение всей фокусной плоскости на экране.
