Двухфотонная флуоресцентная микроскопия имеет множество преимуществ:
1) Более длинные волны света меньше подвержены рассеянию, чем более короткие волны света, проникающие в образец;
(2) Флуоресцентные молекулы за пределами фокальной плоскости не возбуждаются, поэтому больше возбуждающего света может достичь фокальной плоскости, так что возбуждающий свет может проникнуть глубже в образец;
3) Более длинные волны ближнего инфракрасного диапазона менее токсичны для клеток, чем более короткие волны;
4) При наблюдении образца в двухфотонном микроскопе фотообесцвечивание и фототоксичность присутствуют только в фокальной плоскости. Поэтому двухфотонные микроскопы более подходят, чем однофотонные, для наблюдения за толстыми образцами, для наблюдения за живыми клетками или для проведения точечных экспериментов по фотообесцвечиванию.
Знание конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Основной принцип конфокальной флуоресцентной микроскопии: для облучения образца используется точечный источник света, образующий небольшую, четко выраженную световую точку в фокальной плоскости. Флуоресценция, излучаемая из этой точки после облучения, собирается объективом и направляется обратно в светоделитель, состоящий из двунаправленного хроматического зеркала, вдоль первоначального пути облучения. Делитель луча направляет флуоресценцию непосредственно на детектор. И источник света, и детектор имеют перед собой точечное отверстие, называемое точечным отверстием освещения и точечным отверстием обнаружения соответственно. Оба имеют одинаковую геометрию, около 100-200 нм, и сопряжены относительно точки света на фокальной плоскости, т. е. точка света проходит через ряд линз и в конечном итоге может быть сфокусирована как на освещающей и детекторные отверстия. Таким образом, свет из фокальной плоскости может сходиться внутри апертуры зонда, в то время как рассеянный свет сверху или снизу фокальной плоскости блокируется за пределами апертуры зонда и не может быть отображен. Лазер сканирует образец точка за точкой, а трубка фотоумножителя после обнаружения точечного отверстия также получает конфокальное изображение соответствующей световой точки точка за точкой, которое преобразуется в цифровой сигнал и передается на компьютер и, наконец, сходится в четкое изображение. конфокальное изображение всей фокальной плоскости на экране.
Каждое изображение в фокальной плоскости фактически представляет собой оптическое сечение образца, и это оптическое сечение всегда имеет определенную толщину, также известную как оптический лист. Поскольку интенсивность света в фокальной точке намного больше, чем в нефокальной точке, а свет нефокальной плоскости отфильтровывается точечным отверстием, глубина резкости конфокальной системы приближается к нулю, и сканирование вдоль направления оси Z позволяет оптической томографии формировать двумерный оптический срез образца, который можно наблюдать в фокальном пятне. Сочетая сканирование плоскости XY (фокальной плоскости) со сканированием по оси Z (оптической оси), трехмерное изображение образца можно получить путем накопления последовательных слоев двухмерных изображений, которые обрабатываются специализированным компьютерным программным обеспечением.
Это означает, что точечное отверстие обнаружения и отверстие источника света всегда фокусируются в одной и той же точке, так что флуоресценция, возбуждаемая за пределами фокальной плоскости, не может проникнуть в точечное отверстие обнаружения.
Принцип работы лазерного конфокального устройства просто выражается в том, что он использует лазер в качестве источника света на основе традиционного флуоресцентного микроскопа, дополнительного устройства лазерного сканирования и сопряженного фокусирующего устройства, посредством компьютерного управления для выполнения системы получения и обработки цифровых изображений.
